E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與肺癌易感性的meta分析研究

曾園園 劉仍允 張洪濤

肺癌是全世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的癌癥類型，且是導(dǎo)致癌癥患者死亡的首要因素[1]。盡管80%-90%的肺癌發(fā)生與吸煙相關(guān)，但肺癌的發(fā)生是一個(gè)多步驟、多因素參與的復(fù)雜的生物學(xué)過程，涉及多種遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)的改變[2]。作為一種重要的表觀遺傳修飾方式，DNA甲基化可以通過促進(jìn)抑癌基因失活、原癌基因激活以及增加染色體不穩(wěn)定性等多種方式，在肺癌等多種腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島或啟動(dòng)子附近區(qū)域的異常甲基化引起轉(zhuǎn)錄抑制從而導(dǎo)致此類基因的活性降低甚至蛋白表達(dá)丟失是肺癌發(fā)生過程中的常見事件[4]。

E-cadherin基因（Cadherin-1, CDH1）位于染色體16q22.1，該基因編碼的上皮細(xì)胞鈣粘蛋白E-cadherin是一個(gè)分子量為120 kDa的跨膜糖蛋白，屬于鈣依賴性上皮細(xì)胞黏附分子，在維持上皮的極性和結(jié)構(gòu)完整性等方面起著重要作用[5]。在肺癌等多種癌癥患者體內(nèi)E-cadherin表達(dá)降低，而抑制E-cadherin的表達(dá)下調(diào)可以阻止腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，說明該基因與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，且在腫瘤發(fā)展過程中發(fā)揮著抑癌基因的作用[6]。研究[7-9]表明，在乳腺癌、膀胱癌和胃癌等多種腫瘤中，E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)甲基化與E-cadherin表達(dá)下調(diào)或缺失有關(guān)，提示該基因甲基化參與了這些癌癥的發(fā)生過程。然而，在肺癌中雖有多項(xiàng)研究曾涉及E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)甲基化與肺癌發(fā)生的關(guān)系，但這些研究所得的結(jié)果并不完全一致。因此，為了更好地探討E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)甲基化與肺癌易感性之間的關(guān)系，我們收集、整理先前學(xué)者的所有研究數(shù)據(jù)，并進(jìn)行meta分析。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集 為了全面檢索涉及E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與肺癌易感性關(guān)系的研究，我們使用“E-cadherin”、“CDH1”、“methylation”和“l(fā)ung cancer”等作為關(guān)鍵詞，利用PubMed/MedLine和EMBASE數(shù)據(jù)庫檢索發(fā)表于2013年3月以前的所有文獻(xiàn)，并將綜述類文獻(xiàn)仔細(xì)閱讀，以期從中得到相關(guān)的原始研究性文章的信息。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)及數(shù)據(jù)整理 如果某研究運(yùn)用了病例-對(duì)照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)且E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化頻率可以從該文獻(xiàn)中獲取，那么該文章將被納入當(dāng)前的meta分析。如果兩項(xiàng)或多項(xiàng)研究擁有重疊或重復(fù)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，那么我們只納入包含更大樣本量的研究。兩位研究者（曾園園和劉仍允）獨(dú)立檢索數(shù)據(jù)庫并閱讀文獻(xiàn)。在排除明顯不符合納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)后，閱讀可能符合的文獻(xiàn)全文，以確定其是否真正符合納入標(biāo)準(zhǔn)。隨后，兩位研究者交叉核對(duì)納入文獻(xiàn)的結(jié)果，兩人的納入結(jié)果完全一致。對(duì)于符合納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)， 每一篇文獻(xiàn)均按照作者、發(fā)表年份、實(shí)驗(yàn)人群所在的國家、實(shí)驗(yàn)人群的種族，以及患者和對(duì)照組人群的數(shù)量、甲基化檢測(cè)方法以及實(shí)驗(yàn)材料的來源進(jìn)行整理（表1）。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與肺癌易感性關(guān)系的強(qiáng)弱程度用優(yōu)勢(shì)比（odds ratio, OR）及95%置信區(qū)間（confidence interval, CI）表示，而OR值是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義采用Z檢驗(yàn)進(jìn)行分析。根據(jù)實(shí)驗(yàn)人群的種族、甲基化檢測(cè)方法和實(shí)驗(yàn)材料來源的不同執(zhí)行亞組分析。使用以卡方檢驗(yàn)為基礎(chǔ)的Q檢驗(yàn)衡量樣本的同質(zhì)性[10]，并以I2值的大小反應(yīng)多組研究之間同質(zhì)性的程度（I2值越小，同質(zhì)性越強(qiáng)）[11]。當(dāng)各研究間具有較好同質(zhì)性時(shí)，采用基于Mantel-Haenszel方法的固定效應(yīng)模型來分析meta分析的結(jié)果；反之，采用基于DerSimonian and Laird方法的隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行分析[12,13]。使用基于Begg檢驗(yàn)為基礎(chǔ)的漏斗圖（Funnel plot）檢測(cè)數(shù)據(jù)之間是否存在發(fā)表偏倚，采用Egger檢驗(yàn)進(jìn)行計(jì)算[14]。上述所有統(tǒng)計(jì)分析均采用STATA軟件（Stata/SE version 10.1 for Windows; Stata Corp, College Station, Texas），P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 被納入的研究的基本信息 根據(jù)我們的檢索條件及納入標(biāo)準(zhǔn)，共有13項(xiàng)研究被納入當(dāng)前的meta分析[15-27]（表1）。這13項(xiàng)研究共涉及1,288例實(shí)驗(yàn)樣本，包含692例肺癌樣本和596例對(duì)照樣本。其中7項(xiàng)研究（涉及378例肺癌樣本和342例對(duì)照樣本）源自亞洲人群，3項(xiàng)研究（163例肺癌樣本和142例對(duì)照樣本）源自高加索人群，另外3項(xiàng)研究（151例肺癌樣本和112例對(duì)照樣本）涉及兩種以上的人群。此外，其中12項(xiàng)研究的研究對(duì)象為組織樣本，另外1項(xiàng)為血液樣本。在分析樣本甲基化狀態(tài)時(shí)，其中有9項(xiàng)研究采用了甲基化特異性PCR（MSP）的方法，另外4項(xiàng)使用了MethyLight分析、三維微列陣分析（3-D microarray）等其它實(shí)驗(yàn)方法。

2.2 E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與肺癌易感性 將收集到的13項(xiàng)研究的數(shù)據(jù)全部納入meta分析，我們發(fā)現(xiàn)這些研究之間存在很強(qiáng)的異質(zhì)性（P＜0.001，I2=74.9%，表2），因此我們采用隨機(jī)效應(yīng)模型來分析E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與肺癌易感性的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)E-cadherin基因甲基化可以明顯增加肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（OR=4.04，95%CI:2.00-8.13，P＜0.001，圖1）。按照實(shí)驗(yàn)人群的種族進(jìn)行亞組分析后，在亞洲人群和高加索人群中仍然可見E-cadherin基因甲基化與肺癌易感性呈明顯正相關(guān)的現(xiàn)象（P=0.020，P＜0.001，表2）。按照樣本來源和甲基化檢測(cè)方法進(jìn)行亞組分析的結(jié)果表明：在組織來源的研究以及使用MSP為檢測(cè)方法的研究中E-cadherin基因甲基化可以明顯增加肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

2.3 發(fā)表偏倚分析 使用OR值的自然對(duì)數(shù)及其標(biāo)準(zhǔn)誤創(chuàng)建基于Begg檢驗(yàn)為基礎(chǔ)的漏斗圖來衡量發(fā)表偏倚（圖2），該漏斗圖呈現(xiàn)出良好的對(duì)稱性，說明我們的meta分析并不存在發(fā)表偏倚。此外，Egger檢驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)了漏斗圖的結(jié)果（t=0.39, P=0.707）。

表1 納入meta分析的13項(xiàng)研究的基本特征Tab 1 Characteristics of 13 studies included in the meta-analysis

表2 E-cadherin基因甲基化與肺癌易感性Tab 2 Summary of E-cadherin methylation and lung cancer risk

3 討論

抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化導(dǎo)致抑癌基因轉(zhuǎn)錄失活的生物學(xué)過程參與了肺癌等多種癌癥的發(fā)生。E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)異常甲基化是導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)下調(diào)或缺失的一個(gè)重要原因，并參與了乳腺癌、膀胱癌、子宮癌和胃癌等多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程[7-9,28]。有研究表明，在肺癌患者體內(nèi)E-cadherin表達(dá)降低[29]。因此，E-cadherin基因甲基化可能是導(dǎo)致其蛋白表達(dá)降低的一個(gè)重要原因，進(jìn)而改變了患肺癌的易感性，參與了肺癌發(fā)生。基于此，多位研究者探索了E-cadherin基因甲基化與肺癌發(fā)生的關(guān)系，然而這些研究得出的結(jié)論存在一定的分歧。

圖1 E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與肺癌易感性關(guān)系的meta分析Fig 1 Meta-analysis of the association between E-cadherin promoter methylation and lung cancer risk

圖2 關(guān)于E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與肺癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)研究的漏斗分析圖Fig 2 Funnel plot analysis on the association of E-cadherin promoter methylation with risk of lung cancer

本研究采用meta分析的方法，首次系統(tǒng)性地分析了E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化與肺癌易感性的關(guān)系。我們對(duì)先前發(fā)表的13項(xiàng)研究的數(shù)據(jù)（共包含692例肺癌樣本和596例對(duì)照樣本）進(jìn)行分析，結(jié)果表明E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化可以明顯增加肺癌易感性，且我們的亞組分析數(shù)據(jù)表明這種相關(guān)性同時(shí)存在于亞洲人群和高加索人群。因此，我們推測(cè)E-cadherin與其它某些重要抑癌基因甲基化的作用模式相類似，即它們的啟動(dòng)子區(qū)甲基化參與肺癌發(fā)生過程在各類人種中具有普遍性。

除了根據(jù)人種進(jìn)行亞組分析以外，我們還根據(jù)納入研究的甲基化研究方法和研究材料進(jìn)行了亞組分析。我們發(fā)現(xiàn)在使用MSP為檢測(cè)方法的研究中E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化增加了肺癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而使用其它檢測(cè)方法的研究并不能表明E-cadherin基因甲基化與肺癌易感性相關(guān)，這可能是由于使用這些方法的研究所涉及的樣本量較小而導(dǎo)致的。納入當(dāng)前meta分析的研究大多都采用組織樣本為研究對(duì)象，只有1項(xiàng)研究（包含20例患者和10例對(duì)照者）選用了血液樣本[21]，盡管這項(xiàng)研究不能夠直接表明E-cadherin基因甲基化與肺癌易感性相關(guān)，我們不能排除使用大樣本量血液樣本的研究得到相關(guān)的可能性，因?yàn)樵谠撗芯恐蠩-cadherin基因甲基化頻率在肺癌患者和對(duì)照組中存在較大差異：分別為20%和0%。

檢測(cè)所納入的研究間的異質(zhì)性是meta分析的重要組成部分，我們使用Q檢驗(yàn)和I2值的大小對(duì)所涉及的研究是否具有異質(zhì)性做了詳細(xì)分析，在執(zhí)行總體分析和亞組分析時(shí)根據(jù)異質(zhì)性存在與否選擇性使用隨機(jī)效應(yīng)或固定效應(yīng)模型對(duì)E-cadherin基因甲基化與肺癌易感性的關(guān)系進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)。除異質(zhì)性分析以外，發(fā)表偏倚的檢測(cè)也尤為重要。本研究中，我們運(yùn)用基于Begg檢驗(yàn)的漏斗圖衡量發(fā)表偏倚情況，并使用Egger檢驗(yàn)對(duì)漏斗圖的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果漏斗圖和Egger檢驗(yàn)顯示出良好的一致性，這些均提示當(dāng)前的meta分析不存在發(fā)表偏倚。

綜上所述，當(dāng)前的meta分析表明E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化增加了肺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。盡管我們的結(jié)論需要更大的樣本量以及亞洲和高加索人群以外的樣本中進(jìn)行驗(yàn)證，但由于E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化在肺癌發(fā)生過程中是一個(gè)頻發(fā)事件，因此E-cadherin基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化有望成為檢測(cè)肺癌發(fā)生的一個(gè)潛在分子指標(biāo)。