高效液相色譜法測定嬰幼兒乳制品中免疫球蛋白IgG的含量

高 旭 ，鄭永杰 ，譚陽陽，郭 巖

（1.齊齊哈爾大學 化學與化學工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾市質(zhì)量檢測中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.牡丹江出入境檢驗檢疫局，黑龍江 牡丹江 157021；4.哈爾濱工業(yè)大學 理學院，黑龍江 哈爾濱 150001）

免疫球蛋白（IgG）是一種具有抗體活性的球蛋白。IgG不易被胰蛋白酶水解，可以直接滲透腸壁進入血液，因此，IgG對嬰兒的胃腸道具有保護作用[1-3]。國內(nèi)外IgG的檢測方法有：酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法、免疫膠體金法、免疫擴散法、免疫比濁法、免疫電泳法、毛細管電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法等。其中高效液相色譜法具有靈敏度高，分析速度快，檢出限低等特點。本實驗是對高效液相色譜測定嬰幼兒乳制品中免疫球蛋白IgG含量的方法進行優(yōu)化。分別對流速、柱溫、流動相的pH值、檢測波長等因素進行優(yōu)化，確定最佳的IgG的液相色譜條件。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

KH2PO4、K2HPO4、甘氨酸、HCl、H3PO4、NaOH、乙腈（色譜純）、乙醇（色譜純）、嬰幼兒乳制品、IgG標準品（美國Sigma公司）。

高效液相色譜儀HP1100(美國安捷倫公司)；Hi-Trap protein GHP色譜柱（1 mL美國安捷倫公司）；Venusil XBP-NH2氨基柱（5μm，100?，4.6×250mm日本島津GL公司）；Hjchrom Wonbasil C18柱（5μm，4.6×250mm美國安捷倫公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制 IgG標準儲備液：精確稱取25mg IgG標準品，用0.05mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液（pH值為6.5）稀釋到25mL，得到的IgG標準儲備液濃度為1.0mg·mL-1。并用0.05mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液（pH值為6.5） 將其稀釋成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg·mL-1的標準溶液。

1.2.2 樣品前處理 稱取嬰兒配方奶粉2g，用0.05 mol·L-1磷酸鹽緩沖液溶解，渦旋5min，8000r·min-1、4℃下離心30min去除脂肪，取脫脂乳，用乳酸調(diào)pH值至4.6，超聲后8000r·min-1、4℃下離心40min，去除剩余的油脂和蛋白，取上清液，過0.45μm微孔濾膜待測。

1.2.3 色譜條件 本實驗分別使用 C18柱、XBP-NH2氨基柱和Hi-Trap protein GHP1mL色譜柱對IgG進行分析。Hjchrom Wonbasil C18柱和Venusil XBP-NH2氨基柱所用流動相為0.05mol·L-1、pH值6.5的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）和乙腈（95:5）；流速1.0mL·min-1；檢測波長280nm；進樣量20μL；柱溫25℃。使用Hi-Trap protein GHP1mL色譜柱分析時，流動相A：0.05mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液（pH值6.7），流動相B：0.05mol·L-1甘氨酸鹽緩沖液（pH值2.7）；流速0.4mL·min-1；檢測波長280nm；進樣量20μL；柱溫25℃，按表1的梯度條件進行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫條件Tab.1 Gradient elution conditions

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

使用二級管在200～400nm波長范圍內(nèi)對IgG標準品進行全光譜掃描，如圖1所示，免疫球蛋白IgG標準品在220nm和280nm處均有強吸收峰，一般物質(zhì)在220nm處都有吸收，干擾較大。因此，確定其檢測波長為280nm。

圖1 IgG 標準品掃描光譜圖Fig.1 Scan spectrum diagram of IgG standard product

2.2 色譜柱的選擇

分別用Hjchrom Wonbasil C18柱、Venusil XBPNH2氨基柱及Hi-Trap protein GHP 1mL色譜柱對IgG標準品進行定性定量分析，通過判斷其響應值的大小及分離效果，確定最終檢測所用的分離柱。

用Hjchrom Wonbasil C18柱對免疫球蛋白IgG標準系列進行檢測時，沒有找到IgG的目標峰；用Venusil XBP-NH2氨基柱對免疫球蛋白IgG標準系列進行檢測，雖確定了IgG的目標峰，但響應值極小，當進樣濃度為1.0mg·mL-1時，其響應值不足10mAU，并且分離效果也非常不好；而用Hi-Trap protein GHP 1mL色譜柱對免疫球蛋白IgG標準系列進行檢測時，其分離效果、色譜峰形及響應值均可達到滿意效果，在此色譜條件下的IgG標樣色譜圖見圖2，圖中保留時間tR=11.352的峰為IgG目標峰。因此，選擇Hi-Trap protein GHP 1mL色譜柱為檢測嬰幼兒乳制品中免疫球蛋白IgG含量的分離柱。

圖2 IgG 標準品色譜圖Fig.2 HPLC of IgG standard product

2.3 流速的選擇

在流速為0.2、0.4、0.6mL·min-1條件下分別對0.2mg·mL-1IgG標準液進行檢測，流速對峰面積影響見表2。

表2 流速選擇對峰面積影響Tab.2 Influence of the flow rate selection for peak area

從表2中得出，流速對峰面積的影響較小，隨著流速的增大峰面積稍有減小的趨勢，流速從0.2 mL·min-1變到0.6mL·min-1，峰面積僅減小3.9 mAU。但在色譜分析中，在不超過柱壓和滿足分離要求的同時，應盡量選擇稍大的流速。此柱所能承受的柱壓上限10bar，當流速為0.6mL·min-1時超過此柱柱壓上限。因此，選擇0.4mL·min-1作為Hi-Trap protein GHP1mL色譜柱檢測時的最佳流速。

2.4 柱溫的選擇

在柱溫為25、30、35、45℃條件下分別對0.2mg·mL-1IgG標準液進行檢測，柱溫對峰面積影響見表3。

表3 柱溫選擇對峰面積影響Tab.3 Influence of the column temperature selection for peak area

從表3中得出，當柱溫在25～35℃范圍內(nèi)，峰面積隨柱溫的升高稍有增加，但當超過35℃以后，峰面積呈減小趨勢。主要原因是：當溫度超過35℃以后，純度較高的免疫球蛋白IgG的熱穩(wěn)定性將會降低，將有少量IgG會失活，最終導致峰面積減小。在室溫條件下操作就能得到響應值較大目標峰峰值。因此，選擇25℃作為Hi-Trap protein GHP 1mL色譜柱檢測時的最佳柱溫。

2.5 流動相p H 值的選擇

Hi-Trap protein G HP 1mL色譜柱的填料為蛋白GSepharose HP，首先固定洗脫液B（0.05mol·L-1甘氨酸鹽緩沖液）pH值，依次調(diào)結(jié)合液A（0.05mol·L-1磷酸鹽緩沖液）pH值為6.1、6.3、6.5、6.7、6.9，然后固定結(jié)合液A的pH值，依次調(diào)洗脫液B的pH值為2.1、2.3、2.5、2.7、2.9，分別在設定條件下對1.0mg·mL-1IgG標準液進行檢測。結(jié)合液pH值與其峰面積的關(guān)系見表4。洗脫液pH值與其峰面積的關(guān)系見表5。

表4 結(jié)合液pH 值選擇對峰面積影響Tab.4 Influence of the pH of combined liquid selection for peak area

由表4得出，在pH值為6.7時，IgG目標峰峰面積最大，說明其結(jié)合能力最強。主要原因是：當洗脫能力相同時，結(jié)合力越強，結(jié)合的IgG量越多，則洗脫下來的IgG量就越多，響應值越大。因此，選擇pH值為6.7的0.05mol·L-1的磷酸鹽緩沖液為Hi-Trap protein GHP1mL色譜柱的結(jié)合液。

表5 洗脫液pH 值選擇對峰面積影響Tab.5 Influence of the pH of eluent liquid selection for peak area

由表5得出，在pH值為2.7時，IgG目標峰峰面積最大，說明其洗脫能力最強。主要原因是：當結(jié)合能力相同時，結(jié)合的IgG量相同，洗脫力越強，洗脫的IgG量越多，響應值越大。因此，選擇pH值為2.7的0.05 mol·L-1甘氨酸鹽緩沖液為Hi-Trap protein GHP1 mL色譜柱的洗脫液。

3 結(jié)論

本實驗主要對免疫球蛋白IgG的高效液相色譜法進行了優(yōu)化，并建立了嬰幼兒乳制品中的IgG提取的前處理方法。實驗對色譜條件中所用的分離柱進行了對比選擇，對所選用的分離柱的流速、柱溫及流動相pH值進行了優(yōu)化。最終確定最佳色譜條件為：Hi-Trap protein GHP 1mL色譜柱，檢測波長280 nm，流速0.4mL·min-1，柱溫25℃，結(jié)合液A為pH值為6.7的0.05mol·L-1的磷酸鹽緩沖液，洗脫液B為pH值為2.7的0.05mol·L-1的甘氨酸鹽緩沖液。

［1］鄭崢，馬彥科.牛初乳的開發(fā)利用及研究進展［J］.生物技術(shù)通訊，2010，（4）:746-748.

［2］馬艷麗.牛初乳的營養(yǎng)保健功能及開發(fā)利用［J］.中國食物與營養(yǎng)，2011，（8）:182-187.

［3］徐麗.牛初乳中免疫球蛋白的提取與活性保持技術(shù)研究［D］.北京:中國農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文，2005.1-7.