鎘脅迫下蘿卜根系蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)

章愛秀，劉曉穎，邊立娜，彭永康

（天津師范大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院，b.天津市動植物抗性重點實驗室，天津300387）

土壤中的Cd2+可以抑制植物正常的光合作用，使卡爾文循環(huán)和光合作用電子傳遞系統(tǒng)受阻[1]、光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）中許多蛋白質(zhì)被抑制表達(dá)或失去活性[2]，引起植物產(chǎn)生亞致死損傷[3].不同于其他的重金屬，Cd2+可以通過農(nóng)產(chǎn)品進(jìn)入人類的食物鏈，導(dǎo)致人體的骨骼疼痛、腎臟損害甚至誘發(fā)腫瘤[4].因此，研究Cd2+對農(nóng)作物生長的影響及農(nóng)作物的耐Cd2+機制，對減少農(nóng)作物產(chǎn)量損失、防止Cd2+污染農(nóng)產(chǎn)品、減少人類因食用含Cd2+農(nóng)產(chǎn)品而導(dǎo)致的疾病具有重要意義.目前對于植物在高Cd2+濃度下忍耐和適應(yīng)Cd2+危害機理的研究已取得了一些進(jìn)展，如Hart等[5]研究了在不同濃度的Cd2+條件下，硬粒小麥結(jié)合、吸收和轉(zhuǎn)運Cd2+的調(diào)控機制；Shah等[6]以水稻為材料，研究了水稻植株不同器官對Cd2+吸收和積累的情況；Rivera-Becerril等[7]研究了叢枝菌根在降低豌豆Cd2+危害上的作用；Ouzounidou等[8]研究了Cd2+損傷小麥葉細(xì)胞超顯微結(jié)構(gòu)的機理；另外，還有一些研究證實了Cd2+會干擾植物蛋白質(zhì)的合成以及其他許多代謝過程[9-12].

轉(zhuǎn)錄組學(xué)（Transcriptomics）是從整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及調(diào)控規(guī)律的學(xué)科，近年來一些學(xué)者利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù)研究Cd2+脅迫條件下植物如何調(diào)控基因的表達(dá)[13-17]，探討mRNA與其指導(dǎo)合成的蛋白質(zhì)之間的關(guān)系，取得了大量研究成果[18].蛋白質(zhì)組學(xué)是在整體水平上研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)組成及其活動規(guī)律的學(xué)科，利用蛋白質(zhì)組技術(shù)研究多種植物的 Cd2+危害，如水稻（Oryza sativa）[19-20]、擬南芥（Arabidopsis thaliana）[21-22]、黃豆（Glycine max）[23]、楊樹（Populus alba）[2]等，結(jié)果表明，Cd2+可以影響光合作用電子傳遞系統(tǒng)、GSH生物合成、ATP代謝等相關(guān)蛋白的差異表達(dá).

蘿卜作為廣泛栽種的農(nóng)作物之一，其耐Cd2+機理的研究相對較少，尤其是利用蛋白質(zhì)組技術(shù)對此類問題進(jìn)行的研究.本課題組利用該技術(shù)對蘿卜的根系全蛋白質(zhì)組和根系線粒體蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析，試圖了解蘿卜在Cd2+脅迫下參與抗性反應(yīng)的蛋白質(zhì)及其變化，探討蘿卜的Cd2+害及耐Cd2+機理.同時，此研究也為農(nóng)業(yè)上利用蛋白質(zhì)組技術(shù)檢測蔬菜的Cd2+害以及系統(tǒng)分析蔬菜的耐Cd2+機理提供一種技術(shù)手段，為蔬菜安全生產(chǎn)提供服務(wù).

1 材料與方法

1.1 植物材料與培養(yǎng)

選取飽滿、大小均一的小沙窩蘿卜（Raphanus sativus L.）種子，經(jīng)質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的HgCl2表面消毒5 min，用自來水沖洗2次，置于鋪有蒸餾水濕潤的定性濾紙的培養(yǎng)皿中連續(xù)培養(yǎng).22℃恒溫光照條件下培養(yǎng)16 h后，18℃恒溫黑暗條件下繼續(xù)培養(yǎng)8 h.3 d后用濃度分別為10、50、100、150 μmol/L的CdCl2處理幼苗12 h（根施），切取胚根為蛋白質(zhì)分析樣品，對照組樣品為未經(jīng)處理的3 d幼苗胚根.

1.2 蛋白制備

1.2.1 根系全蛋白的制備

制備蛋白質(zhì)樣品參照Yan等[24]的方法.在液氮中將根尖組織快速冷凍研磨，用含質(zhì)量濃度0.7 mg/mL二硫蘇糖醇（DTT）的體積分?jǐn)?shù)為10%的冷丙酮懸浮勻漿液，-20℃下溫育1 h.在4℃下3 500×g離心5 min，用含質(zhì)量濃度0.7 mg/mL DTT的丙酮重懸離心所得的碎片沉淀，-20℃下溫育1 h，再在4℃下1 500×g離心30 min.上述步驟重復(fù)3次.樣品凍干后溶解于樣品緩沖液中[8mol/L尿素，35 mmol/L Tris，質(zhì)量濃度 40 mg/mL 3-二乙胺-丙磺酸（CHAPS），體積分?jǐn)?shù)為1%且pH為5～7的兩性離子，體積分?jǐn)?shù)為0.4%pH3～10的兩性離子，質(zhì)量濃度為10 mg/mL的DTT].樣品蛋白質(zhì)含量的測定參考Bradford[25]的方法，用牛血清白蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn).

1.2.2 根系線粒體分離與線粒體蛋白質(zhì)制備

稱取胚根30 g，剪成5～10 mm長度的碎片，加入100 mL預(yù)冷的研磨介質(zhì)[0.3 mol/L甘露醇，50 mmol/L焦磷酸鈉，質(zhì)量濃度為5 mg/mL的BSA，5 mg/mL的聚乙烯吡咯烷酮-40（PVP40），2 mmol/L乙二醇-雙-四乙酸（EGTA），20 mmol/L半胱氨酸（Cys），pH8.0]，在細(xì)胞破碎儀上破碎均勻后，用4層無菌紗布過濾，收集濾液.濾液在4℃下1000×g離心5min，取上清液，4℃下18000×g離心15min，棄上清液.用研磨介質(zhì)重懸得到的沉淀，重復(fù)一次上面2步離心過程.用甘露醇緩沖液[0.3 mol/L甘露醇，1 mg/mL BSA，10 mmol/L N-三甲基-2-氨基乙磺酸-氫氧化鈉（TES-NaOH），pH7.5]重懸得到的細(xì)胞器沉淀.預(yù)備質(zhì)量濃度分別為180、230、400 mg/mL的Percoll與甘露醇緩沖液的混合液，按照上述濃度混合液的體積比為2∶4∶1在離心管中自上向下排列.將重懸液鋪在離心管中Percoll的不連續(xù)梯度混合液上，4℃下40 000×g離心45 min，吸出在230和400 mg/mL Percoll的分界處出現(xiàn)的不透明條帶，該條帶即為線粒體條帶.4℃下15 000×g離心15 min，沉淀即為濃縮的線粒體.

用甘露醇緩沖液重懸之后，鋪在自形成的Percoll梯度緩沖液上，即含280 mg/mL Percoll的蔗糖緩沖液[0.3 mol/L蔗糖，1 mg/mL BSA，10 mmol/L TES-NaOH，pH7.5]上，4℃下40000×g離心30min.在Percoll梯度的頂端形成線粒體條帶，Percoll梯度底端形成的條帶則為過氧化物酶物質(zhì).吸出線粒體條帶，4℃下15 000×g離心15 min.

用甘露醇緩沖液重懸沉淀，4℃下15 000×g再次離心15 min.重復(fù)上一步，即可得到較純的線粒體沉淀.將丙酮加入到線粒體樣品中至最終體積分?jǐn)?shù)為80%，抽提蛋白質(zhì)，-20℃下放置4 h.4℃下20 000×g離心15 min后，用等電聚焦裂解液[6 mol/L尿素，2 mol/L硫脲，20 mg/mL CHAPS，體積分?jǐn)?shù)2%兩性電解質(zhì)，2 mmol/L三丁膦，0.01 mg/mL溴酚藍(lán)]重懸沉淀，置于冰上2 h.

1.3 雙向凝膠電泳（2-DE）分析

蛋白質(zhì)的雙向凝膠電泳（2-DE）分析參閱Castro等[26]的方法進(jìn)行.使用長度為13 cm的pH3～10的固相化pH梯度（IPG）膠條，操作步驟參照Bio-Rad產(chǎn)品說明書.取待測蛋白樣品60 μg，用樣品緩沖液稀釋至300 μL，將干的IPG膠條放在含待測樣品的緩沖液中，300 V下水化10 h，使待測樣品吸入到膠條中.第一向等電聚焦參數(shù)設(shè)定如下：300 V下1 h，1 000 V下1 h，8 000 V下2 h.等電聚焦結(jié)束后將膠條放在膠條平衡液中[60 mmol/L Tris-HCl，pH6.8，10 mg/mL DDT，10 mg/mL甘氨酸，20 mg/mL十二烷基硫酸鈉（SDS）]平衡20 min.第二向12.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）參考Laemmli[27]的方法進(jìn)行.將等電聚焦后的膠條放在第二向凝膠的上面，用含0.15 mol/L Bis-Tris、0.1 mol/L HCl和2 mg/mL SDS的10 mg/mL瓊脂糖封膠，凝固后在80 V下電泳5 h，結(jié)果重復(fù)3次.采用銀染法[28]染色顯現(xiàn)結(jié)果.用GS-800考馬斯亮藍(lán)對MS分析膠染色，色譜掃描儀記錄圖像，用PDQuest軟件檢測、匹配和鑒別分析凝膠斑點，找出對照組材料和處理組材料之間有差異的蛋白質(zhì)斑點，進(jìn)行基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）分析.

1.4 凝膠消化和MALDI-TOF-MS分析

把經(jīng)鑒別有差別的目標(biāo)蛋白質(zhì)斑點從制備膠上切下，超純水洗3次，用50 mmol/L NH4HCO3脫色2次，經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為100%的乙腈干燥后，在體積分?jǐn)?shù)為50%的乙腈溶液中，用體積分?jǐn)?shù)為0.1%三氟乙酸（TFA）37℃下孵育過夜，混勻、凍干制備物，用含有體積分?jǐn)?shù)為1%的TFA和體積分?jǐn)?shù)為50%的α-氰基-4-羥基肉桂酸溶液溶解制備物等待檢測.利用ABI4700型（美國）正離子生物質(zhì)譜儀進(jìn)行MALDI-TOF MS分析，胰蛋白酶自動降解片段為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)校正.使用MASCOT軟件在NCBInr綠色植物數(shù)據(jù)庫（Viridiplantae）上進(jìn)行查詢，明確其歸屬.

2 結(jié)果與分析

利用2-DE技術(shù)，分析蘿卜幼苗經(jīng)10、50、100和150 μmol/L Cd2+處理12 h后胚根中全蛋白質(zhì)組和線粒體蛋白質(zhì)組的情況.結(jié)果表明，經(jīng)10 μmol/L Cd2+誘導(dǎo)后胚根中的蛋白質(zhì)組沒有產(chǎn)生變化；在濃度為50 μmol/L Cd2+下，蛋白質(zhì)斑點包括全蛋白質(zhì)組和線粒體蛋白質(zhì)組開始出現(xiàn)變化，主要表現(xiàn)在蛋白質(zhì)的含量上，即部分蛋白質(zhì)的表達(dá)產(chǎn)生上調(diào)、下調(diào)現(xiàn)象，幾乎沒有出現(xiàn)新誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)斑點或某些蛋白質(zhì)斑點的抑制表達(dá)現(xiàn)象，如表1所示；但在100 μmol/L時，胚根中的全蛋白質(zhì)組和線粒體蛋白質(zhì)組均有明顯變化，統(tǒng)計結(jié)果表明，共有44個蛋白質(zhì)斑點產(chǎn)生變化，其中新誘導(dǎo)蛋白質(zhì)斑點1個，抑制表達(dá)蛋白質(zhì)斑點7個，上調(diào)6個，下調(diào)30個，與處理濃度50 μmol/L Cd2+相比，出現(xiàn)了個別蛋白質(zhì)斑點的誘導(dǎo)形成和部分原有蛋白質(zhì)斑點抑制合成的現(xiàn)象；Cd2+濃度150 μmol/L下處理蘿卜幼苗，其全蛋白質(zhì)組和線粒體蛋白質(zhì)組的變化與Cd2+濃度100 μmol/L下的處理結(jié)果類似.

表1 不同濃度Cd2+處理12 h后蘿卜幼苗胚根蛋白質(zhì)組變化Tab.1 Changes in root proteomic of radish seedlings treated with different concentration of Cd2+for 12 h

2.1 胚根全蛋白質(zhì)組

利用2-DE技術(shù)，新得到的胚根全蛋白質(zhì)組譜型見圖1，第一向水平軸表示的是等電聚焦，pH范圍是4.5～8.6，第二向為表示相對分子質(zhì)量的SDSPAGE垂直膠，相對分子質(zhì)量范圍為1.4×104～9.7×104（生物學(xué)表示為14～97 kDa）.圖中箭頭指的是有含量變化或新誘導(dǎo)出和消失的蛋白質(zhì)斑點.

在對照組（0 μmol/L）和處理組（100 μmol/L）中，多于1 000個左右的蛋白質(zhì)斑點被檢測到，其中有22個蛋白質(zhì)斑點在與Cd2+反應(yīng)中表現(xiàn)出差異表達(dá)現(xiàn)象，包括11個蛋白質(zhì)斑點（斑點4、斑點9～18）下調(diào)，4個蛋白質(zhì)斑點（斑點19～22）上調(diào)，7個蛋白質(zhì)斑點（斑點 1～3、5～8）被抑制表達(dá).對這 22個與Cd2+誘導(dǎo)相關(guān)的蛋白質(zhì)進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析，結(jié)果見表2，質(zhì)譜鑒別的Cd2+誘導(dǎo)后抑制表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點中7個蛋白質(zhì)斑點的歸屬得到鑒別.表3為蛋白質(zhì)含量上調(diào)和下調(diào)的蛋白質(zhì)斑點，除斑點22沒有鑒別外，其余蛋白質(zhì)歸屬均得到鑒別.

圖1 蘿卜幼苗經(jīng)100 μmol/L CdCl2處理12 h后根系內(nèi)全蛋白質(zhì)組的變化Fig.1 Changes in root proteomic of radish seedlings treated with 100 μmol/L CdCl2for12 h

2.2 胚根線粒體蛋白質(zhì)組

蘿卜幼苗經(jīng)Cd2+誘導(dǎo)后，根系中超過400個線粒體蛋白質(zhì)斑點被檢測到，有22個線粒體蛋白質(zhì)產(chǎn)生變化，其中19個蛋白質(zhì)（斑點1～19）下調(diào)，2個斑點（斑點20～21）上調(diào)，1個新的線粒體蛋白質(zhì)斑點（斑點22）被誘導(dǎo)合成（圖2）.

表2 根系全蛋白質(zhì)組內(nèi)被抑制表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點Tab.2 Inhibition expressed proteins identified by MALDI-TOF-MS in root proteomic

表3 根系全蛋白質(zhì)組內(nèi)上調(diào)和下調(diào)的蛋白質(zhì)斑點Tab.3 Differential expressed proteins（down-or up-regulated）identified by MALDI-TOF-MS in root proteomic

圖2 蘿卜幼苗經(jīng)100 μmol/L CdCl2處理12 h后根系線粒體差異表達(dá)蛋白質(zhì)組的變化Fig.2 Changes in root mitochondrial proteomic of radish seedlings treated with 100 μmol/L CdCl2for 12 h

通過質(zhì)譜分析，18個線粒體蛋白質(zhì)的歸屬得到鑒別，結(jié)果見表4.22個斑點中有4個斑點因所鑒別的蛋白質(zhì)斑點得分偏低或?qū)嶒炈玫降牡鞍踪|(zhì)相對分子質(zhì)量小、pI與理論值偏差高而未能鑒別.

表4 上調(diào)和下調(diào)的線粒體蛋白質(zhì)斑點Tab.4 Differential expressed mitochondrial proteins（down-or up-regulated）identified by MALDI-TOF-MS

3 討論

利用蛋白質(zhì)組技術(shù)研究作物的Cd2+害及耐Cd2+機理已有很多報道.在水稻中，Cd2+可以影響正常的光合作用，損壞與光合作用相關(guān)的蛋白，如RUBisco；100 μmol/L Cd2+可以誘導(dǎo)一些調(diào)控蛋白如ERI類受體蛋白激酶、細(xì)胞分裂素氧化酶以及一些與代謝相關(guān)的酶，如肉桂醇脫氫酶[24].在擬南芥中，發(fā)現(xiàn)Cd2+能激活碳、氮和硫代謝，促使合成一些螯合分子，如植物螯合肽（phytochelatin PC）或它的前體GSH[26].在楊樹中發(fā)現(xiàn)Cd2+會嚴(yán)重影響卡爾文循環(huán)和光合作用電子傳遞系統(tǒng)[2]，多種與此相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)豐度減少.在綠藻中也得出與楊樹相同的實驗結(jié)果.這些研究為了解植物的Cd2+害及耐Cd2+機理提供了很多幫助，為生產(chǎn)上減少Cd2+害造成的損失也有一定意義.但此類研究針對葉片蛋白質(zhì)組方面偏多，而直接接觸Cd2+害的組織胚根蛋白質(zhì)組則相對較少.

本研究以沙窩蘿卜為材料，研究了不同Cd2+濃度（10、50、100、150 μmol/L）處理 12 h后，蘿卜根系中蛋白質(zhì)組的變化.結(jié)果表明，根系全蛋白質(zhì)組中約有1000多個蛋白質(zhì)斑點、根系線粒體蛋白質(zhì)組中約有400多個蛋白質(zhì)斑點被檢測到.Cd2+濃度小于50 μmol/L時，不足以引起上述2種蛋白質(zhì)組的變化；在Cd2+濃度為50 μmol/L時，均發(fā)現(xiàn)根系全蛋白和線粒體蛋白質(zhì)組有部分蛋白表達(dá)豐度上的變化；變化最明顯的是Cd2+濃度達(dá)到100 μmol/L時，根系的蛋白質(zhì)組中有7種蛋白質(zhì)被抑制表達(dá)，從新鑒別的蛋白質(zhì)功能歸屬上，有負(fù)責(zé)種子發(fā)芽、幼苗生長貯藏營養(yǎng)的cruciferin（斑點1）、行使基因中內(nèi)含子剪接的maturase K（斑點2）、負(fù)責(zé)DNA合成（斑點3）、不良環(huán)境抗御（斑點5）、基因轉(zhuǎn)錄（斑點8）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（斑點6）以及細(xì)胞結(jié)構(gòu)維持（斑點7）等相關(guān)蛋白.根系中除了抑制表達(dá)的8種蛋白之外，至少還有14種蛋白質(zhì)的表達(dá)量產(chǎn)生明顯變化，從所鑒別的功能看，這些產(chǎn)生上調(diào)或下調(diào)的蛋白質(zhì)，其基本功能涉及基因轉(zhuǎn)座、RNA合成、蛋白質(zhì)剪切與折疊、能量代謝等.根系線粒體蛋白質(zhì)組檢測結(jié)果表明，有15種位于線粒體中的蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度發(fā)生變化，這些變化的線粒體蛋白質(zhì)除有2種蛋白質(zhì)的歸屬未被鑒別外，其余13種線粒體蛋白質(zhì)中，有 6種蛋白質(zhì)（斑點 1、3、5、9、12、13）與能量代謝相關(guān).

本研究通過蛋白質(zhì)組技術(shù)，分析蘿卜幼苗根系對Cd2+脅迫的反應(yīng)，得到的初步實驗結(jié)果有2個方面：（1）50 μmol/L Cd2+開始引起蘿卜根系蛋白質(zhì)組的變化，Cd2+濃度為100 μmol/L時有多種蛋白質(zhì)丟失和表達(dá)豐度上產(chǎn)生變化，從蛋白質(zhì)組角度可以認(rèn)為，50～100 μmol/L是蘿卜對Cd2+反應(yīng)的臨界劑量；（2）蛋白質(zhì)組技術(shù)不僅可以了解蘿卜在Cd2+誘導(dǎo)下體內(nèi)轉(zhuǎn)譯水平上蛋白質(zhì)組的變化，也可以解釋轉(zhuǎn)譯后修飾的蛋白質(zhì)組變化的信息，藉此可以全面了解植物Cd2+害及耐Cd2+機理.

[1]HAJDUCH M，RAKWAL R，AGRAWAL G K，et al.High-resolution two-dimensional electrophoresis separation of proteins from metal-stressed rice（Oryza sativa L.） leaves：Drastic reductions/frag-mentation of ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase and induction of stress-related proteins[J].Electrophoresis，2001，22（13）：2824—2831.

[2]KIEFFER P，DOMMES J，HOFFMANN L，et al.Quantitative changes in protein expression of cadmium-exposed poplar plants[J].Proteomics，2008，8（12）：2514—2530.

[3]GASIC K，KORBAN S S.Transgenic Indian mustard（Brassica juncea）plants expressing an Arabidopsis phytochelatin synthase（AtPCS1）exhibit enhanced As and Cd tolerance[J].Plant Mol Biol，2007，64（4）：361—369.

[4]JARUP L，ALFVEN T.Low level cadmium exposure，renal and boneeffects-theOSCARstudy[J].Biometals，2004，17（5）：505—509.

[5]HART J J，WELCH R M，NORVELL W A，et al.Characterization of cadmium binding，uptake，and translocation in intact seedlings of bread and durum wheat cultivars[J].Plant Physiol，1998，116（4）：1413—1420.

[6]SHAH K，DUBEY R S.A 18 kDa cadmium inducible protein complex：Its isolation and characterization from rice（Oryza sativa L.）seedlings[J].J Plant Physl，1998，152（4/5）：448—454.

[7]RIVERA-BECERRIL F，CALANTZIS C，TURNAU K，et al.Cadmium accumulation and buffering of cadmium-induced stress by arbuscular mycorrhiza in three Pisum sativum L genotypes[J].J Exp Bot，2002，53（371）：1177—1185.

[8]OUZOUNIDOU G，MOUSTAKAS M，ELEFTHERIOU E P.Physiological and ultrastructural effects of cadmium on wheat（Triticum aestivumL.）leaves[J].ArchEnvironContamToxicol，1997，32（2）：154—160.

[9]SIESKO M M，F(xiàn)LEMING W J，GROSSFELD R M.Stress protein synthesis and peroxidase activity in a submersed aquatic macrophyte exposed to cadmium[J].Environ Toxicol Chem，1997，16（8）：1755—1760.

[10]SHUKLA U C，SINGH J，JOSHI P C，et al.Effect of bioaccumulation of cadmium on biomass productivity，essential trace elements，chlorophyll biosynthesis，and macromolecules of wheat seedlings[J].Biol Trace Elem Res，2003，92（3）：257—274.

[11]ROMERO-PUERTAS M C，PALMA J M，GOMEZ M，et al.Cadmium causes the oxidative modification of protein in pea plants[J].Plant Cell Environ，2002，25（5）：677—686.

[12]UEKI S，CITOVSKY V.The systemic movement of a tobamovirus is inhibited by a cadmium-ion-induced glycine-rich protein[J].Nat Cell Biol，2002，4（7）：478—486.

[13]WEBER M，TRAMPCZYNSKA A，CLEMENS S.Comparative transcriptome analysis of toxic metal responses in Arabidopsis thaliana and the Cd2+-hypertolerant facultative metallophyte Arabidopsis halleri[J].Plant Cell Environ，2006，29（5）：950—963.

[14]SUDO E，ITOUGA M，YOSHIDA-HATANAKA K，et al.Gene expression and sensitivity in response to copper stress in rice leaves[J].J Exp Bot，2008，59（12）：3465—3474.

[15]ABERCROMBIE J M，HALFHILL M D，RANJAN P，et al.Transcriptional responses of Arabidopsis thaliana plants to As（V）stress[J].BMC Plant Biology，2008，8：87.

[16]NORTON G J，LOU-HING D E，MEHARG A A，et al.Rice-arsenate interactions in hydroponics：whole genome transcriptional analysis[J].J Exp Bot，2008，59（8）：2267—2276.

[17]VAN DE MORTEL J E，SCHAT H，MOERLAND P D，et al.Expression differences for genes involved in lignin，glutathione and sulphate metabolism in response to cadmium in Arabidopsis thaliana and the related Zn/Cd-hyperaccumulator Thlaspi caerulescens[J].Plant Cell Environ，2008，31（3）：301—324.

[18]GYGI S P，ROCHON Y，F(xiàn)RANZA B.R，et al.Correlation between protein and mRNA abundance in yeast[J].Mol Cell Biol，1999，19（3）：1720—1730.

[19]AHSAN N，LEE S H，LEE D G，et al.Physiological and protein profiles alternation of germinating rice seedlings exposed to acute cadmium toxicity[J].C R Biologies，2007，330（10）：735—746.

[20]AINA R，LABRA M，F(xiàn)UMAGALLI P，et al.Thiol-peptide level and proteomic changes in response to cadmium toxicity in Oryza sativa L.roots[J].Environ Exp Bot，2007，59（3）：381—392.

[21]ROTH U，ROEPENACK-LAHAYE E V，CLEMENS S.Proteome changes in Arabidopsis thaliana roots upon exposure to Cd2+[J].J Exp Bot，2006，57（15）：4003—4013.

[22]SARRY J E，KUHN L，DUCRUIX C，et al.The early responses of Arabidopsis thaliana cells to cadmium exposure explored by protein and metabolite profiling analyses[J].Proteomics，2006，6（7）：2180—2198.

[23]SOBKOWIAK R，DECKERT J.Proteins induced by cadmium in soybean cells[J].J Plant Physiol，2006，163（11）：1203—1206.

[24]YAN S P，TANG Z C，SU W，SUN W A，et al.Proteomic analysis of salt stress-responsive proteins in rice root[J].Proteomics，2005，5（1）：235—244.

[25]BRADFORD M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding[J].Anal Biochem，1976，72（1/2）：248—254.

[26]CASTRO A J，CARAPITO C，ZORN N，et al.Proteomic analysis of grapevine（Vitis vinifera L.）tissues subjected to herbicide stress[J].J Exp Bot，2005，56（421）：2783—2795.

[27]LAEMMLI U K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J].Nature，1970，227（5259）：680—685.

[28]WRAY W，BOULIKAS T，WRAY V P，et al.Sliver staining of proteins in polyacrylamide gels[J].Anal Biochem，1981，118（1）：197—203.