預(yù)處理對(duì)絲素促進(jìn)293T細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

趙 培，龐廣昌，王雪青，田 強(qiáng)，姚 遠(yuǎn)，王 菲

（天津商業(yè)大學(xué)a.生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，b.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134）

絲素是將蠶絲脫膠后得到的天然蛋白質(zhì)，不溶于水.由于絲素蛋白具有良好的易加工性[1]和氧氣及水的滲透性，被廣泛應(yīng)用于組織工程細(xì)胞生長(zhǎng)支架、臨床診斷、外科修復(fù)、治療等方面[2-3].絲素蛋白所具有的2種不同結(jié)晶結(jié)構(gòu)（silk I和silk II），成為細(xì)胞和組織沿軸向生長(zhǎng)的物質(zhì)基礎(chǔ)[4].但純絲素一般溶失率很高，不經(jīng)溶化處理（甲醇浸泡或濕熱）的絲素蛋白，強(qiáng)度較大，伸長(zhǎng)很小，玻璃轉(zhuǎn)化溫度（Tg）超過200℃，又硬又脆，很難在生物體內(nèi)使用，所以必需經(jīng)預(yù)處理后才可以作為細(xì)胞黏附的基質(zhì)[5-6].

本研究采用不同的脫膠方法、包埋方式、纏繞方式對(duì)絲素進(jìn)行預(yù)處理，制得改性絲素，通過細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)研究其生物學(xué)特性，期望能夠?qū)z素蛋白材料進(jìn)行改良，而且有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞與蠶絲

細(xì)胞為293T細(xì)胞（人胚腎細(xì)胞）；蠶絲為正常繭紡絲，購自遼寧太源紡織有限公司.

1.1.2 試劑與儀器

RPMI-1640培養(yǎng)液：上?？寺∩锘瘜W(xué)試劑（北京）有限公司；小牛血清：北京華利森泰生物科技有限公司；質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%的胰蛋白酶、MTT：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所科技公司；其他試劑，包括DMSO、聚乙二醇、明膠、殼聚糖等，均采用國(guó)產(chǎn)分析純.

Nikon Ti倒置顯微鏡；Thermo Labsystems酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀；Thermo Scientific Heraeus HERAcellCO2培養(yǎng)箱；SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司生產(chǎn).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 293T細(xì)胞的培養(yǎng)

質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90%的RPMI-1640培養(yǎng)液中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清和0.1%的雙抗（青霉素和硫酸慶大霉素），37℃培養(yǎng).

1.2.2 蠶絲預(yù)處理

先將蠶絲置于沸水中20 min，除雜.

2種脫膠方法：酶脫膠法和NaHCO3脫膠法.將蠶絲分別放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%的胰蛋白酶溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%的NaHCO3溶液中（浴比同為1∶40），37℃恒溫下消化12 h.

2種腐蝕方法：將等量絲素分別放入1.0 mol/L HCl、1.0 mol/L NaOH中常溫保存1 h.

2種包埋方法：明膠包埋，將等量的絲素放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%的明膠水溶液中，常溫保存1 h；殼聚糖/聚乙二醇包埋，稱取0.6 g殼聚糖，少量醋酸溶解，除去雜質(zhì)，氨水調(diào)節(jié)pH值至5，透析除去醋酸、醋酸胺等小分子.稱取0.24 g聚乙二醇，加入20 mL雙蒸水，溶解，倒入殼聚糖溶液中，攪拌均勻，超聲振蕩，除去氣泡，滴加到絲素上.按上述方法制得的樣品用雙蒸水漂洗3次，然后37℃烘干，制得干性絲素薄膜片.用紫外線照射消毒30min，待用.

3種纏繞方法：脫膠絲素分別擰成1股、2股、3股螺旋狀.

1.2.3 絲素-293T復(fù)合培養(yǎng)

將制備好的絲素支架置于6孔板內(nèi).取處于對(duì)數(shù)期的293T細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為2×104/mL，取1 mL滴于支架上.37℃培養(yǎng)4 h，待細(xì)胞充分吸附在支架上后，加入4 mL培養(yǎng)基培養(yǎng)，每天換液，培養(yǎng)7 d，每個(gè)實(shí)驗(yàn)2個(gè)平行.

1.2.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

將絲素-293T復(fù)合培養(yǎng)體取出，以培養(yǎng)基反復(fù)輕輕吹打支架，直至顯微觀察蠶絲上無附著細(xì)胞，計(jì)數(shù).96孔板，每孔加細(xì)胞100 μL，培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)基，加MTT使其終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL，培養(yǎng)4 h.每孔加入150 μL的DMSO，酶標(biāo)儀上振蕩混勻，測(cè)定OD570值.每孔3個(gè)平行.

1.2.5 培養(yǎng)條件正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

按L9（34）設(shè)計(jì)4因素、3水平實(shí)驗(yàn)進(jìn)行選擇，正交實(shí)驗(yàn)因素水平見表1.

表1 蠶絲預(yù)處理方法考察因素及水平Tab.1 Factors and levels on the study of pretreated silk fibroin

2 結(jié)果與討論

2.1 293T細(xì)胞的生長(zhǎng)形態(tài)

293T細(xì)胞是半貼壁半懸浮生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞，但在培養(yǎng)時(shí)貼附在支持物表面的生長(zhǎng)情況要好于懸浮狀態(tài).細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后形態(tài)發(fā)生變化，在游離態(tài)時(shí)，細(xì)胞為透明的圓球形；貼壁生長(zhǎng)時(shí)變?yōu)椴灰?guī)則圓形或橢圓形、梭形、多角形，同時(shí)形成許多偽足狀突起，相鄰細(xì)胞伸出數(shù)個(gè)長(zhǎng)突起向外延伸，如圖1.

圖1 293T細(xì)胞在培養(yǎng)瓶中的生長(zhǎng)形態(tài)Fig.1 Growth state of 293T in cell culture flask

2.2 293T細(xì)胞在支架上的生長(zhǎng)狀態(tài)

圖2 揭示出不同預(yù)處理方式對(duì)293T細(xì)胞與蠶絲的黏附有一定的影響，主要表現(xiàn)在是否脫膠與包埋方式上.已證明人們不期望的免疫反應(yīng)是由絲膠蛋白引起的[7].由圖2可以看出，在脫膠后裸露的絲素（4～9）上都有較多細(xì)胞黏附.采用HCl和NaOH腐蝕蠶絲的目的是用酸或堿腐蝕絲素表面，造成表面粗糙，表觀看HCl和NaOH腐蝕與無腐蝕差別不大（2與3、5與6、8與9）.就包埋方式而言，經(jīng)明膠包埋的絲素上的293T細(xì)胞呈線、片平鋪（4、9）.圖2也顯示出殼聚糖/聚乙二醇處理的絲素上的293T細(xì)胞多數(shù)黏附在絲素纖維上，且聚集呈團(tuán)簇狀生長(zhǎng)，并沿絲素纖維生長(zhǎng)，生長(zhǎng)旺盛（5）.這是由于混合處理時(shí)聚乙二醇增加了絲素的親水性，聚乙二醇分子中存在大量乙氧基，能夠與水形成氫鍵，具有良好的親水性，且親水性的材料表面有利于細(xì)胞的黏附生長(zhǎng)[8].聚乙二醇鏈在水中的高遷移率促進(jìn)了293T細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)，混合了殼聚糖后，纖維的韌性、彈性、細(xì)胞黏附性和增值能力均顯著提高.何領(lǐng)好等[9]也證實(shí)殼聚糖/聚乙二醇共混膜隨著聚乙二醇含量的增加，膜的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度、結(jié)晶度和剛度降低.可見幾種處理方法相比，以殼聚糖/聚乙二醇聯(lián)合作用的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)最佳.這與其他研究者關(guān)于殼聚糖/聚乙二醇對(duì)細(xì)胞的生物相容性結(jié)果相似[10-12].就纏繞方式而言，293T細(xì)胞黏附在1股絲素纖維表面上且生長(zhǎng)的較密集，而在2股和3股絲素纖維上不僅生長(zhǎng)在單根絲素上，而且還生長(zhǎng)在2股或3股絲素纖維之間的夾縫中（4，6）.

圖2 9組實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞在絲素上的生長(zhǎng)狀態(tài)Fig.2 Growth state of 9 groups′experiments cells on silk fibroin

上述結(jié)果為培養(yǎng)3 d，實(shí)驗(yàn)4～6發(fā)現(xiàn)，處理時(shí)間越長(zhǎng)293T細(xì)胞與絲素結(jié)合得越緊密，不受外力干擾，操作時(shí)洗脫越難.培養(yǎng)7 d的細(xì)胞團(tuán)緊密結(jié)合成不規(guī)則團(tuán)塊狀，密布于絲素表面，但培養(yǎng)基澄清透明.而實(shí)驗(yàn)1～3培養(yǎng)7 d時(shí)若不及時(shí)換液，板底見大片泛白死細(xì)胞，輕搖就有細(xì)胞浮起.

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明：細(xì)胞與支架間黏附作用受材料表面性質(zhì)、細(xì)胞與材料接觸時(shí)間、材料的柔韌性等多種因素影響，材料本身的生物相容性也決定了細(xì)胞在材料表面的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)及增殖、分化的能力.

2.3 絲素預(yù)處理方式對(duì)細(xì)胞數(shù)和活力的影響

以不同的脫膠方法、包埋方式、纏繞方式對(duì)蠶絲進(jìn)行預(yù)處理的正交實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)結(jié)果如表2，直觀分析和方差分析見表3和表4.

表2 預(yù)處理對(duì)絲素促進(jìn)293T細(xì)胞生長(zhǎng)的正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果Tab.2 Orthogonal design and results of pretreated silk fibroin to promote the growth of 293T

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的直接分析Tab.3 Direct analysis on the orthogonal design results

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的方差分析Tab.4 Analysis of variance of orthogonal test

根據(jù)表3對(duì)4因素的極差（R）進(jìn)行比較，可見脫膠方法的極差最大，其次是包埋法，腐蝕法與纏繞法之間的差異并不大.極差越大，在該因素的水平變動(dòng)時(shí)293T細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)與活力變化就越大，也就是該因素對(duì)293T細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的影響越大.因此，按照極差大小順序排列，可知脫膠方法是影響293T細(xì)胞在絲素支架上生長(zhǎng)的主要因素.K1、K2、K3之間的差異是因?yàn)橥灰蛩厝?個(gè)不同的水平所引起的，K值大表明某一因素在該水平下處理效果最好.根據(jù)水平之間K值大小比較得知，若要獲得高的生物量其最佳組合為胰蛋白酶脫膠、NaOH腐蝕、殼聚糖/聚乙二醇包埋、2股纏繞；若要獲得高的細(xì)胞活性其最佳組合為胰蛋白酶脫膠、HCl腐蝕、殼聚糖/聚乙二醇包埋、3股纏繞.根據(jù)表4可知，脫膠方法與包埋法對(duì)結(jié)果的影響最明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≤0.01）.

不管哪種方式處理后的絲素支架對(duì)293T細(xì)胞的吸附效果均強(qiáng)于未脫膠蠶絲，且便于取放和易于保持構(gòu)型.本研究中對(duì)蠶絲預(yù)處理后作為293T細(xì)胞生長(zhǎng)的支架，獲得了高生物量與高活性的293T細(xì)胞.絲素支架經(jīng)培養(yǎng)后293T細(xì)胞生物量由2×104/mL最大增加到7×105/mL左右，增長(zhǎng)量為35倍，明顯高于陸旋等[13]以常規(guī)靜電紡絲法得到的增長(zhǎng)量；并高于葉榮等[14]的小鼠胚胎細(xì)胞ES在絲素蛋白膜或明膠上生長(zhǎng)后的MTT活性測(cè)定結(jié)果.由表3的結(jié)果可知，腐蝕法與纏繞法之間的差異并不大，據(jù)此認(rèn)為對(duì)絲素進(jìn)行的腐蝕步驟可以省略.至于纏繞方式在組織工程中的應(yīng)用，2股和3股絲素纖維的機(jī)械強(qiáng)度要好于1股絲素纖維，具有較高的抗拉伸力學(xué)性能.鑒于目前所制備的絲素支架都是絲素纖維排列緊密、網(wǎng)孔小的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[15]或成膜結(jié)構(gòu)[16-17]，而絲素可以制成海綿狀、膜狀、纖維狀和網(wǎng)狀等，因此制備細(xì)胞培養(yǎng)支架時(shí)，根據(jù)具體的情況也可以選擇使用多股絲素.

3 結(jié)論

3.1 293T細(xì)胞在絲素上的生長(zhǎng)

293T細(xì)胞在處理過的絲素上經(jīng)過3 d培養(yǎng)后，在材料表面普遍都能很好地生長(zhǎng)，細(xì)胞突起明顯，貼附良好，多數(shù)細(xì)胞突起減少，胞體變圓.經(jīng)過7 d培養(yǎng)后，細(xì)胞呈球狀體、錐形體，有的還會(huì)形成偽足突起向外延伸，大量附著在絲素纖維上呈集落性生長(zhǎng).在絲素纖維上生長(zhǎng)的293T細(xì)胞與在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)的細(xì)胞相比表現(xiàn)出更加立體的形態(tài).

3.2 不同預(yù)處理方式對(duì)293T細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞活力的影響

正交實(shí)驗(yàn)分析表明：脫膠方法對(duì)293T細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞活力的影響最大；其次是包埋法；腐蝕法與纏繞法之間的差異并不大.若要獲得高的生物量，最佳組合為胰蛋白酶脫膠、NaOH腐蝕、殼聚糖/聚乙二醇包埋、2股纏繞；若要獲得高的細(xì)胞活性，最佳組合為胰蛋白酶脫膠、HCl腐蝕、殼聚糖/聚乙二醇包埋、3股纏繞.脫膠方法與包埋法對(duì)結(jié)果的影響最顯著，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P≤0.01）.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)因操作過程而產(chǎn)生一定的誤差，是由于絲素支架接種細(xì)胞后，在換液和補(bǔ)加培養(yǎng)液時(shí)不可避免地會(huì)沖擊細(xì)胞-絲素支架復(fù)合物，這時(shí)未牢固吸附于支架的細(xì)胞會(huì)脫落，并且細(xì)胞濃度降低也會(huì)造成細(xì)胞吸附的機(jī)會(huì)減少.但這種影響對(duì)研究細(xì)胞在蠶絲支架上生長(zhǎng)情況的總體趨勢(shì)并無太大影響.脫膠后絲素纖維與293T細(xì)胞具有良好的生物相容性，并且有利于293T細(xì)胞的存活，同時(shí)對(duì)其表型或功能沒有任何大的毒害作用，說明絲素表面經(jīng)處理后有利于細(xì)胞的黏附和增殖.

[1]ZHANG X，BAUGHMAN C B，KAPLAN D L.In vitro evaluation of electrospun silk fibroin scaffolds for vascular cell growth[J].Biomaterials，2008，29（14）：2217—2227.

[2]孫芳，謝軍軍，熊杰，等.納米／亞微米再生絲素蛋白纖維制備的影響因素[J].浙江理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，26（1）：1—6.

[3]EUN S G，DAVID J F，SAMUEL M H，et a1.Silk fibroin membranes from solvent-crystallized silk fibroin/gelatin blends：Effects of blend and solvent composition[J].Materials Science and Engineering：C，2007，27（3）：426—431.

[4]LIN H B，SUN W，MOSHER D F，et a1.Synthesis，surface，and cell adhesion properties of polyurethanes containing covalently grafted RGD peptides[J].J Biomed Mater Research，1994，28（3）：329—342.

[5]LYENGAR D R，PERUTZ S M，DAIC A，et a1.Surface segregation studies of fluorine-containing diblock copolymers[J].Macromolecules，1996，29（4）：1229—1234.

[6]盧神州，李明忠，高鴨坤，等.應(yīng)力對(duì)絲素膜結(jié)構(gòu)與性能的影響[J].蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)：工科版，2004，24（1）：1—4.

[7]YANG Y M，CHEN X M，DING F，et a1.Biocompatibility evaluation of silk fibroin with peripheral nerve tissues and cells in vitro[J].Biomaterials，2007（28）：1643—1652.

[8]KUO S M，TSAI S W，HUANG L H，et al.Plasma-modified nylon meshes as supports for cell culturing[J].Artif Cells Blood Substit Immobile Biotechnology，1997，25（6）：551—562.

[9]何領(lǐng)好，楊德彬，劉瑩，等.殼聚糖/聚乙二醇共混膜性能研究[J].鄭州輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，22（4）：35—37，40.

[10]張宇，周初松，蔣剛彪，等.殼聚糖/聚乙二醇琥珀酸酯薄膜的制備及其與肌成纖維細(xì)胞的相容性[J].中國(guó)組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11（18）：3527—3531.

[11]ZHANG M，LI X H，GONG Y D，et a1.Properties and biocompatibility of chitosarf films modified by blending with PEG[J].Biomaterials，2002，23（13）：2641—2648

[12]ZENG M F，F(xiàn)ANG Z P，XU C W.Effect of compatibility on the structure of the microporous membrane prepared by selective dissolution of chitosan/synthetic polymer blend membrane[J].J Membrane Sci，2004，230：175—181.

[13]陸旋，朱正華，周曉紅.促細(xì)胞生長(zhǎng)再生復(fù)合絲素蛋白電紡絲非織布的性能[J].蠶業(yè)科學(xué)，2010，36（1）：97—101.

[14]葉榮，盛利琴，陳學(xué)進(jìn)，等.小鼠胚胎干細(xì)胞與復(fù)合絲素膜的生物相容性研究[J].中國(guó)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào)，2009，28（4）：567—572.

[15]吳海濤，鐘翠平，顧云娣.蠶絲在軟骨細(xì)胞立體培養(yǎng)中的應(yīng)用[J].中國(guó)修復(fù)重建外科雜志，2000，14（5）：101—104.

[16]WANG Y，KIM H J，VUNJAK-NOVAKOVLC G，et a1.Stem cellbased tissue engineering with silk biomaterials[J].Biomaterials，2006，27（36）：6064—6082.

[17]ALTMAN G H，DIAZ F，JAKUBA C，et a1.Silk-based biomaterials[J].Biomaterials，2003，24（3）：401—416.