小麥赤霉病菌拮抗菌AF0907的分離鑒定及其拮抗特性

徐劍宏， 王建偉， 胡曉丹， 祭 芳， 史建榮

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品質(zhì)量安全與檢測研究所，江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室—省部共建國家重點實驗室培育基地，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)重點實驗室，江蘇省轉(zhuǎn)基因安全評價公共服務(wù)中心，江蘇 南京 210014)

赤霉病是小麥、玉米等多種禾谷類作物的一種重要病害，廣泛分布于世界溫暖潮濕地區(qū)［1-7］，在長江中下游和江淮麥區(qū)的發(fā)生更為嚴(yán)重。尤其是近年來，由于小麥機械收割程度不斷提高，秸稈大量還田，麥糠吹散在田間，使小麥赤霉病發(fā)生逐漸加重［8-9］。在赤霉病的防治過程中大多使用化學(xué)藥劑，但是化學(xué)藥劑會對人類的身體健康和環(huán)境造成嚴(yán)重的危害。生物防治在植物病害的防治過程中發(fā)揮了很大的作用［10-11］，利用拮抗菌來控制赤霉病具有很好的防治效果［12-13］。芽孢桿菌生防菌不僅具有很強的環(huán)境適應(yīng)性，而且是一種既能抑制植物病原菌生長和繁殖，又對人畜無毒，環(huán)境無害，所以具有很好的應(yīng)用前景［14-15］。在生防菌的使用中，生防菌本身在環(huán)境中的適應(yīng)性也是決定生防效果的關(guān)鍵因素。針對長江流域赤霉病發(fā)生嚴(yán)重的狀況，本研究從小麥根際土壤中分離到1株對小麥赤霉病菌有高效拮抗作用的芽孢桿菌AF0907，通過對該拮抗菌的分離鑒定、拮抗譜、拮抗特性及其對小麥赤霉病的田間防治效果的研究，以期為該拮抗菌在小麥赤霉病病害防治中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

病原真菌:小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)、小麥紋枯病(Rizoctonia cerealis)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporium)、葡萄炭疽病菌(Colletotrichum cingulata)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、水稻稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)、水稻惡苗病菌(Gibberella fujikuroi)、煙草赤星病菌(Alternaria alternata)、甜菜褐斑病菌(Cercospora beticola)、花生黑斑病菌(Ceroxpora arachidicola)、煙草灰霉病菌(Alternaria alternata)均為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品質(zhì)量安全與檢測研究所分子技術(shù)與生物安全研究室分離并保存。

培養(yǎng)基:LB培養(yǎng)基成分為蛋白胨10.0 g/L、酵母膏 5.0 g/L、NaCl 2.0 g/L(pH 7.0 ～7.5)和瓊脂15.0～20.0 g/L，用于拮抗菌的分離培養(yǎng);PDA培養(yǎng)基成分為馬鈴薯200.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L和瓊脂15.0～20.0 g/L，用于拮抗菌的對峙培養(yǎng)篩選。

1.2 土樣樣品采集及拮抗菌的分離和篩選

于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥試驗地采集小麥根際土壤，采用序列稀釋法制備不同濃度的土壤稀釋液，分別為1 ×10－7、1 ×10－8、1 ×10－9，取不同稀釋度的土壤懸液100 μl涂于LB培養(yǎng)基上，置于30℃培養(yǎng)48 h后，挑取形態(tài)、顏色等不同的細(xì)菌單菌落經(jīng)純化后，采用平板對峙法測定不同菌株對禾谷鐮刀菌的抑菌活性［16］:在PDA平板距中心25 mm處的4個對稱點接待測細(xì)菌，培養(yǎng)1 d后，分別在平板中央接種小麥赤霉病菌菌塊(菌塊直徑為6 mm)，每個處理重復(fù)3次，在28℃培養(yǎng)5 d后觀察有無抑菌帶的形成(若有抑菌帶的形成，則該測試菌株為拮抗菌)。

1.3 AF0907菌株的鑒定

菌株的生理生化鑒定參照文獻(xiàn)［17］。菌株的16S rDNA全序列克隆和序列測定與比較參照文獻(xiàn)［18］:采用 CTAB 法提取 AF0907 基因組 DNA［18］，并以提取的DNA作為PCR反應(yīng)模板，利用16S rDNA通用引物:正向引物5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，反向引物 5-TACCTTGTTACGACTT-3'，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳驗證PCR產(chǎn)物后送上海生工生物工程公司測序。根據(jù)16S rDNA測序結(jié)果，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov 在線查詢分析，利用 Blast軟件在GenBank中與其他16S rDNA序列進(jìn)行同源性比較，選擇同源性相近的序列用MEGA version 5軟件構(gòu)建AF0907系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 拮抗菌AF0907的拮抗特性研究

1.4.1 拮抗譜的測定 選取抑菌能力較強的拮抗菌AF0907，采用對峙培養(yǎng)法對各種不同的植物病原真菌(小麥赤霉病菌、小麥紋枯病菌、棉花枯萎病菌、葡萄炭疽病菌、油菜菌核病菌、水稻稻瘟病菌、水稻惡苗病菌、煙草赤星病菌、甜菜褐斑病菌、花生黑斑病菌、煙草灰霉病菌)進(jìn)行抑菌活性測定，即在PDA平板距中心25 mm處的4個對稱點接AF0907，培養(yǎng)1 d后，分別在平板中央接種各病原真菌菌塊(菌塊直徑為6 mm)，每個處理重復(fù)3次，上述處理在28℃培養(yǎng)5 d測定抑菌圈的直徑。

1.4.2 拮抗菌對小麥赤霉病菌菌絲的影響 在100 ml PD培養(yǎng)基中接入小麥赤霉菌的菌絲后，加入在PD培養(yǎng)基中培養(yǎng)后處于對數(shù)生長期(OD值為1.5)的 AF0907 培養(yǎng)液10 ml，28 ℃、180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)5 d后，觀察培養(yǎng)液的顏色變化，抽濾，烘干菌絲，測其質(zhì)量，每個處理設(shè)4個重復(fù)，以加入PD培養(yǎng)基作為對照;同時用顯微鏡觀察加入拮抗菌后赤霉菌菌絲的形態(tài)，以未加拮抗菌對峙培養(yǎng)的小麥赤霉病菌菌絲作為對照。

1.4.3 拮抗菌對小麥赤霉病菌孢子萌發(fā)的影響

參照文獻(xiàn)［19］，略有改動，利用6%綠豆湯孢子培養(yǎng)液于25℃光照培養(yǎng)禾谷鐮刀菌5 d后，用PD培養(yǎng)液調(diào)節(jié)至1 ml懸浮液中含有1.0×105個孢子;將AF0907發(fā)酵液用PD培養(yǎng)液分別稀釋10倍、50倍、100倍，然后將孢子懸浮液和不同稀釋度的發(fā)酵液按照1∶1混合，25℃培養(yǎng)12 h后觀察赤霉孢子的萌發(fā)率，以孢子懸浮液和PD培養(yǎng)液的混合液作為對照，每個處理4個重復(fù)。

1.5 拮抗菌AF0907對田間小麥赤霉病的防治效果

田間試驗于2010年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合基地小麥試驗田進(jìn)行，小麥品種為揚麥158，設(shè)6個處理，分別為:噴施赤霉孢子液處理(對照1)、先噴施拮抗菌液再噴赤霉孢子液處理、先噴赤霉孢子液再噴拮抗菌液處理、同時噴施拮抗菌液和赤霉孢子液處理、噴施清水處理(對照2)和噴施拮抗菌液處理，每個處理重復(fù)5次，每次50株。在小麥揚花期之前，進(jìn)行該試驗，20 d后，調(diào)查小麥赤霉病發(fā)病的病小穗率和病情指數(shù)。病小穗率=病小穗數(shù)/總小穗數(shù)×100%;病情指數(shù)=∑100(Hi×i)/(H×4)(Hi:各級嚴(yán)重度對應(yīng)的病穗數(shù);i:病情嚴(yán)重級數(shù);H:調(diào)查總穗數(shù);小麥赤霉病分級標(biāo)準(zhǔn)，0級:無病;1級:發(fā)病部分占整個麥穗的1/4以下;2級:發(fā)病部分占整個麥穗的1/4～1/2;3級:發(fā)病部分占整個麥穗的1/2～3/4;4級:發(fā)病部分占整個麥穗的3/4以上)。

2 結(jié)果

2.1 拮抗菌的分離與篩選

從小麥根系土壤分離到4株小麥赤霉病菌的拮抗細(xì)菌，采用平板對峙法測定其對小麥赤霉病菌的抑菌帶的寬度(菌邊緣到赤霉菌邊緣的垂直距離)，結(jié)果表明，拮抗細(xì)菌AF0907的拮抗效果最為明顯(表1)，因此選擇AF0907進(jìn)行深入研究。

表1 赤霉病菌拮抗菌的拮抗活力Table 1 Antagonistic activity of strains against F.graminearum

2.2 赤霉病菌拮抗菌株AF0907的鑒定

菌株AF0907在LB平板上菌落呈乳白色，直徑2 mm左右，形狀橢圓，中央凹陷，表面干燥，有褶皺，不透明(圖1);生理生化特征結(jié)果(表2)顯示AF0907為革蘭氏陽性，有芽孢、無伴孢晶體的細(xì)菌表2示。把AF0907的16SrDNA基因序列在NCBI上使用Blast比對，從 GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得與 AF0907的16SrDNA序列相近的標(biāo)準(zhǔn)序列數(shù)據(jù)，采用MEGA中的鄰位相連法(Neighbor-joining)構(gòu)建菌株16SrDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。由圖2可知，AF0907與 Bacillus subtilis DSM 10(NR027552)、Bacillus subtilis SBRh5(HQ443229.1)等菌株位于同一個分支上，同源性達(dá)到99%以上，結(jié)合遺傳距離、形態(tài)特征以及生理生化特征，可以把AF0907鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。把菌株AF0907的16SrDNA基因序列遞交GenBank數(shù)據(jù)庫，得到序列的登錄號為GU272021。

圖2 基于16SrDNA的菌株AF0907的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on 16SrDNA sequence of strain AF0907

表2 AF0907菌株的生理生化特征Table 2 Physio-biochemical characteristics of strain AF0907

圖1 AF0907在LB上的菌落形態(tài)Fig.1 The colony morphology of strain AF0907 on LB plate

2.3 拮抗菌AF0907的拮抗特性

2.3.1 拮抗譜 采用對峙培養(yǎng)法測定 Bacillus subtilis AF0907對11種病原菌的拮抗活性，結(jié)果顯示菌株AF0907具有廣譜抗植物病原真菌的特性，除了對小麥赤霉病菌具有很強的拮抗能力外，對其他病原菌，如小麥紋枯病菌、煙草赤星病菌、甜菜褐斑病菌、棉花枯萎病菌等抑菌活性都較強(表3)。

表3 AF0907菌株對不同病原菌的抗菌活性Table 3 Antagonistic activities of strain AF0907 against different plant pathogens

2.3.2 拮抗菌AF0907對小麥赤霉病菌菌絲的影響

在PD培養(yǎng)基中接入小麥赤霉病菌菌絲后，加入拮抗菌AF0907。結(jié)果(表4)顯示，與對照相比，AF0907對赤霉病菌的菌絲生長影響顯著，由對照的0.69 g下降為0.15 g，抑制率達(dá)78.26%。用顯微鏡觀察不同處理的赤霉菌的菌絲，和對照相比，加入拮抗菌處理的赤霉病菌菌絲邊緣形態(tài)異常，不能自由伸展，排列成柵欄狀，一些基質(zhì)菌絲膨大變粗，并且分支增多。

表4 菌株AF0907對小麥赤霉病菌菌絲的影響Table 4 Effect of strain AF0907 on hyphal growth of F.graminearum

2.3.3 拮抗菌AF0907對小麥赤霉菌孢子萌發(fā)的影響 用不同稀釋度的拮抗菌發(fā)酵液處理禾谷鐮刀菌的孢子液后，孢子的萌發(fā)率受到了嚴(yán)重影響，當(dāng)拮抗菌液10倍稀釋時，對孢子萌發(fā)的抑制率達(dá)到93.04%，隨著稀釋度的增加，抑制率有所下降，當(dāng)拮抗菌液100倍稀釋時，抑制率為85.39%(表5)。

表5 AF0907菌液對小麥赤霉菌菌孢子萌發(fā)的影響Table 5 Effect of strain AF0907 on the spore germination of F.graminearum

2.4 拮抗菌AF0907對小麥赤霉病的田間防治效果

把拮抗菌AF0907在揚花期噴施到揚麥158上，調(diào)查小麥赤霉病的發(fā)生情況，由表6可以看出，與噴施清水處理(對照2)相比，直接噴施拮抗菌AF0907的小麥病小穗率由29.24%下降為4.45%，病情指數(shù)由24.44%下降為16.67%，防治效果達(dá)到31.79%。先噴施拮抗菌液再噴施赤霉孢子液處理可以有效地減輕赤霉病的發(fā)病率，對赤霉病的防治效果達(dá)到40.37%，而先噴施赤霉孢子液再噴施拮抗菌液處理下的防治效果為29.26%。

表6 菌株AF0907對小麥赤霉病的田間防治效果Table 6 The field control efficiency of strain AF0907 against F.graminearum

3 討論

小麥赤霉病的危害近年來日趨嚴(yán)重，尤其是2010年和2012年大面積爆發(fā)的小麥赤霉病害對中國的糧食安全造成了很大的危害。對于赤霉病的防治，由于長期使用多菌靈等化學(xué)類農(nóng)藥，在中國很多地方出現(xiàn)了抗藥性問題［20-21］，因此急需一種能控制赤霉病害的替代方法。利用拮抗菌來控制植物病原菌的生長和繁殖具有很好的使用前景，已經(jīng)有一些成功使用的先例［12，22］。芽孢桿菌由于抗逆性強，容易在環(huán)境中定殖，對人畜無害，不污染環(huán)境等優(yōu)點，所以是一種很好的生防菌。本研究從小麥的根系土壤分離到1株對赤霉病菌具有高效抑制作用的拮抗菌AF0907，經(jīng)過菌株的生理生化特性和系統(tǒng)進(jìn)化分析被鑒定為枯草芽孢桿菌。該拮抗菌不但對小麥赤霉病菌具有很好的拮抗能力，而且對其他10種常見的植物病原菌都具有很好的拮抗活性。AF0907和小麥赤霉病菌一起培養(yǎng)時，可以抑制小麥赤霉病菌菌絲的生長，使菌絲邊緣形態(tài)異常，不能自由伸展，一些基質(zhì)菌絲膨大變粗，并且分支增多，同時AF0907還可以抑制小麥赤霉病菌孢子的萌發(fā)，因此在拮抗菌AF0907的作用下，小麥赤霉病菌不能正常生長和繁殖。在田間試驗中，噴施拮抗菌AF0907可以降低小麥赤霉病的發(fā)病程度，防治效果可以達(dá)到15.74%以上，尤其在先噴施拮抗菌，讓其在小麥中定殖后，再噴施赤霉孢子液，可以使防治效果提高到40.37%，因此拮抗菌AF0907在小麥赤霉病的防治中，甚至在其他植物真菌病害的防治中將會有廣泛的應(yīng)用前景。對于生防菌的研究，國內(nèi)外也有不少研究，主要研究拮抗菌的分離鑒定及拮抗特性及拮抗物質(zhì)的純化鑒定?？莶菅挎邨U菌能產(chǎn)生多種抑制植物病原真菌的拮抗物質(zhì)，主要為低分子量的多肽類抗生素和一些高分子量的蛋白質(zhì)類拮抗物質(zhì)［23］。在研究中已經(jīng)初步發(fā)現(xiàn)拮抗菌AF0907產(chǎn)生的拮抗物質(zhì)主要在上清液中，且都能夠耐受一定的pH、溫度等因素的影響，對于具體拮抗物質(zhì)的特性和結(jié)構(gòu)還有待進(jìn)一步研究。

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