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    棉花草甘膦抗性基因CP4-EPSPS的初步定位

    2013-08-02 00:52:28劉吉燾馬曉杰狄佳春陳旭升
    江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報 2013年3期
    關(guān)鍵詞:草甘膦單株抗性

    劉吉燾, 馬曉杰, 狄佳春, 陳旭升

    (1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,江蘇 南京 210095;2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟作物研究所/農(nóng)業(yè)部長江下游棉花與油菜重點實驗室,江蘇 南京 210014)

    (責(zé)任編輯:汪恒英)

    棉花是重要的經(jīng)濟作物,中國是產(chǎn)棉大國,棉農(nóng)因防除棉田雜草每年都需付出大量的人力與物力。草甘膦是一種性能良好的除草劑,具有廣譜除草和土壤中迅速降解的優(yōu)點[1-3],是棉田使用最普遍的除草劑之一。但草甘膦作為除草劑也具有弊端,由于具有廣譜除草,即非選擇性除草的效能,故在殺死雜草的同時也會給棉花帶來傷害?;诖耍瑸榱烁玫乩貌莞熟?,抗草甘膦棉花便應(yīng)運而生。抗草甘膦棉花品種最早出現(xiàn)于1997年,由美國孟山都(Mansanto)公司推出[4]。他們從土壤農(nóng)桿菌變種CP4中分離到編碼抗草甘膦酶(5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶)的基因,并通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化珂字棉312(Coker312),把該基因?qū)朊藁ㄖ仓?,從而使棉花對草甘膦產(chǎn)生抗性[5]。種植抗草甘膦棉花,極大地提高了棉田化學(xué)除草的靈活性和機動性,噴藥時間不受土壤濕度和天氣情況的限制,雜草隨時可治。

    本試驗所采用的抗草甘膦品系G-6是江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花遺傳育種項目組從種質(zhì)系PE-14中篩選純化而來[6],經(jīng)劉新民等[7]分子鑒定,確定其基因來源為人工合成的抗草甘膦基因CP4-EPSPS。本研究通過SSR分子標記技術(shù)對抗性基因CP4-EPSPS進行定位,確定抗性基因的位置,旨在為下一步的基因精細定位,進而深入了解外源基因在染色體中的插入位點機理提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 供試材料

    供試材料為抗草甘膦的陸地棉G-6和不抗草甘膦的海島棉海7124。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 遺傳群體的構(gòu)建和形態(tài)標記調(diào)查 以G-6為母本,海7124為父本雜交,收獲 F1種子。種植F1,通過自交獲得F2種子;F1與G-6雜交得 BC1;F1與海7124雜交得BC2。在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實驗基地種植親本和 F1、F2、BC1、BC2群體,種植方式為營養(yǎng)缽育苗移栽,行距為80 cm,株距為40 cm。在大田用0.2%的草甘膦噴灑各群體,調(diào)查其抗性株與非抗性株;而后對分離群體進行χ2適合性測驗。1.2.2 棉花總DNA提取與PCR擴增 取親本及F2群體單株幼嫩葉片,DNA提取采用CTAB法[8]。PCR 反應(yīng)體系為 10.0 μl,包括 20 ng/μl模板 DNA 1.0 μl、2 mmol/L DNTP 1.0 μl、10 × PCR buffer(含mg2+)、10 mmol/L Primer F 0.6 μl、10 mmol/L Primer R 0.6 μl、5 U/μl Taq DNA 聚合酶 0.1 μl、ddH2O 5.7 μl。PCR反應(yīng)在PTC-200(MJ research)上進行。PCR反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性40 s;56℃退火45 s,72℃延伸1 min,30個循環(huán);最后72℃延伸7 min[9-10]。擴增產(chǎn)物在8.0%聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)上電泳。電泳緩沖液為1×TBE,200 V恒壓電泳。電泳結(jié)束后,參照張軍等[11]方法進行染色。

    1.2.3 抗草甘膦目的基因的分子檢測 利用特異引物F:5'-CCATCCTCTACTGCTTTCCC-3';R:5'-GTCTCACCTTCATCGCCATC-3'[12]進行 PCR 擴增,檢測F2群體中各單株的抗草甘膦目的基因。在恒壓90 V條件下,使用1%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳,最后在熒光燈下觀察目的片段。

    1.2.4 差異標記篩選與目的基因定位 在F2群體中隨機選取抗性植株和不抗植株各10株,每單株取等量葉片,將抗性單株和不抗單株的葉片分別混合,提取總DNA作為近等基因池[13]。利用本實驗室前期從1 350對引物中篩選獲得的分布于棉花26對染色體上的234對SSR核心引物[14],先篩選F2近等基因混池以及兩親本間的多態(tài)性差異標記,而后檢測F2群體共160個單株的基因型。統(tǒng)計多態(tài)性條帶,與G-6帶型相同的個體基因記為“1”,與海7124帶型相同的記為“2”,共顯性雜合帶型記為“3”,缺失記為“0”。采用Join Map4.0軟件進行分子標記的連鎖分析和位點排序,確定目的基因在染色體上的位置[15-17]。

    2 結(jié)果

    2.1 抗草甘膦與不抗草甘膦植株的表型特征

    草甘膦為內(nèi)吸傳導(dǎo)型慢性廣譜滅生性除草劑,主要抑制物體內(nèi)烯醇丙酮基莽草素磷酸合成酶,從而抑制莽草素向苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸的轉(zhuǎn)化,使蛋白質(zhì)的合成受到干擾導(dǎo)致植物死亡。大田噴施草甘膦后調(diào)查發(fā)現(xiàn),噴施草甘膦10 d后,不抗草甘膦植株頂心開始發(fā)黑,葉片從邊緣開始枯萎,植株由上至下枯萎直至棉苗整株死亡。而抗性植株則生長正常,沒有出現(xiàn)枯萎枯死等現(xiàn)象。

    2.2 抗草甘膦性狀在海陸雜交群體中的分離規(guī)律

    調(diào)查海陸雜交6個世代群體在大田的抗性分離情況,結(jié)果見表1,可以看出:陸地棉抗性親本G-6全部表現(xiàn)為抗,海島棉親本海7124全部表現(xiàn)為不抗。雜交F1代均表現(xiàn)為抗;顯性回交群體BC1全部表現(xiàn)為抗;隱性回交群體BC2,其中抗株:不抗株符合1∶1的分離比例;F2代中的抗株:不抗株符合3∶1的分離比例。以上結(jié)果表明,抗草甘膦性狀是由1對顯性基因控制的質(zhì)量性狀。

    表1 G-6和海7124雜交后代抗性分離情況Table 1 The segregation of glyphosate-resistant trait in offspring of G-6×Hai 7124

    同時,利用特異引物對F2定位群體的單株進行抗性基因分子檢測,圖1是F2群體部分單株的分子檢測結(jié)果。由圖可見:非抗性單株無PCR擴增條帶;抗性單株出現(xiàn)了PCR擴增條帶,其擴增長度符合引物設(shè)計長度398 bp,顯示本研究采用的抗草甘膦棉花品種的抗性基因是人工合成的CP4-EPSPS。

    圖1 F2群體部分單株的抗草甘膦基因分子檢測Fig.1 Glyphosate-resistant gene identification of partial plants from F2population

    2.3 CP4-EPSPS基因的分子定位

    利用234對核心引物,通過對雙親與F2混池進行差異性標記篩選,共得到27對多態(tài)性引物。以這27對多態(tài)性引物檢測F2作圖群體每個單株的基因型,結(jié)果得到5個分子標記與目的基因連鎖。這5個分子標記分別為 NAU5417、NAU1339、BNL3992、BNL2448、NAU2140,它們都為共顯性標記。其中具有代表性SSR引物的PAGE電泳圖見圖2。

    圖2 F2作圖群體部分單株的PCR擴增圖譜Fig.2 PCR amplification profile of partial plants from F2population

    查閱Guo等[18]公布的棉花遺傳圖譜,顯示上述5對連鎖標記都位于棉花第5染色體上,從而初步推定目的基因CP4-EPSPS在第5染色體上。進一步細篩位于第5染色體上的其他分子標記,共獲得15個分子標記與目的基因連鎖,而位于目的基因兩側(cè)的分子標記分別為 BNL2448、NAU2140(圖3)。其中標記BNL2448與目的基因的遺傳距離為7.0 cM,標記NAU2140與目的基因的遺傳距離為16.2 cM,因此將目的基因定位在棉花第5染色體上。

    圖3 抗草甘膦基因CP4-EPSPS的連鎖圖Fig.3 The linkage map of glyphosate-resistant gene CP4-EPSPS

    3 討論

    3.1 抗草甘膦基因CP4-EPSPS定位的意義

    轉(zhuǎn)基因棉花在國內(nèi)外已得到普遍推廣與應(yīng)用,但有關(guān)外源基因在染色體體上的定位工作鮮見報道。由于海陸雜交F2群體可以獲得比較多的多態(tài)性標記[19],因此本研究采用了G-6與海7124雜交F2群體作為基因定位群體。定位結(jié)果發(fā)現(xiàn):在棉花染色體5上共有15個標記與草甘膦抗性基因CP4-EPSPS連鎖,從而推斷目的基因位于第5染色體上。將本研究獲得的連鎖圖譜與Guo等[18]報道的遺傳圖譜進行比較,發(fā)現(xiàn)本研究獲得的15對與目的基因連鎖的引物,其中12對引物在染色體上的排序與文獻中完全吻合,但其中有 3對引物(NAU3014、NAU861、NAU5417)的排序與文獻中有所錯位。這可能是本試驗采用的定位群體與Guo等并不完全相同所致。

    CP4-EPSPS是人工合成的一種抗草甘膦基因,對于轉(zhuǎn)基因作物,外源基因在后代中能否穩(wěn)定遺傳和表達是轉(zhuǎn)基因工作成敗的關(guān)鍵。外源基因的拷貝數(shù)多少、整合區(qū)域堿基組成以及結(jié)構(gòu)特點等對于基因的穩(wěn)定表達、抑制基因的沉默發(fā)生具有重要的影響[20]。本研究將CP4-EPSPS初步定位在第5染色體上,接下來可對該基因進行精細定位,然后利用Tail-pcr等技術(shù)來研究該基因的插入熱點[21],分析CP4-EPSPS基因的插入位置及周圍堿基的特點,將為下一步探究外源基因在染色體上的定向插入機理奠定基礎(chǔ)。

    3.2 抗草甘膦棉花的育種應(yīng)用

    目前,草甘膦仍是全球使用最廣泛的除草劑。該除草劑價格低廉,遇土后迅速分解,無環(huán)境污染;但草甘膦對普通棉花具有較強的殺傷作用,在棉花生長期間使用易產(chǎn)生藥害。培育抗草甘膦品種是解決藥害最經(jīng)濟、最有效的手段[22-23]。G-6對草甘膦的抗性是受1對顯性基因控制的質(zhì)量性狀,因此可通過傳統(tǒng)的雜交育種手段,將該基因轉(zhuǎn)育到生產(chǎn)上的主推品種中,培育新一代優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗除草劑的棉花新品種。其次,由于該抗性性狀受顯性單基因控制,可將抗除草劑種質(zhì)系作為雜交配組的父本,配制抗草甘膦雜交棉新組合。通過苗床噴施除草劑即可進行苗床去雜,還可以在苗期快速鑒定雜交棉的制種純度,從而降低群體去雜與雜交制種純度鑒定的成本,顯示其在雜種優(yōu)勢利用方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

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