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    黃芪提取物對鯉急性肝組織損傷的保護(hù)作用

    2013-08-02 00:52:10杜金梁曹麗萍殷國俊

    賈 睿, 杜金梁, 曹麗萍, 徐 跑, 殷國俊

    (中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心,農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無錫 214081)

    近年來,魚類肝膽綜合癥、脂肪性肝損傷、化學(xué)性肝損傷等疾病在全國很多地區(qū)頻繁發(fā)生,給水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來了極大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。這些疾病的病因多樣,但都破壞肝細(xì)胞的正常功能,導(dǎo)致肝細(xì)胞破裂,肝組織發(fā)生病變,肝臟功能下降,最終導(dǎo)致魚類的死亡[3]。目前還沒有有效的防治措施。中草藥在水產(chǎn)動(dòng)物病害防治中的研究已經(jīng)非常廣泛,漁業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐證明,中草藥作為混和劑或飼料添加劑適用于當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的集約化、規(guī)?;a(chǎn)的需要[4]。中草藥制劑在草魚、鰻魚、鱘魚、甲魚等的腸炎防治、免疫力提高中有顯著療效[5]。有研究發(fā)現(xiàn),有些中草藥提取物對肝膽綜合癥,化學(xué)性肝損傷有一定的治療作用[6-7]。中草藥為天然藥物,毒副作用小,對環(huán)境影響小,不宜在魚體內(nèi)富集,符合現(xiàn)代人的綠色消費(fèi)。因此中草藥在水產(chǎn)動(dòng)物肝損傷防治中的應(yīng)用將逐漸擴(kuò)大。

    黃芪為豆科紫云英膜莢黃芪及內(nèi)蒙黃芪的根。廣泛分布于世界溫帶地區(qū),主要為歐洲、亞洲、南美洲等地。黃芪多糖(APS)為黃芪中主要藥用活性成分,其組成為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖。在哺乳動(dòng)物中,黃芪提取物被廣泛的研究,其可提高動(dòng)物免疫力、改善肝細(xì)胞的功能、具有保肝和抗氧化等作用[8-12]。在水產(chǎn)動(dòng)物中,黃芪提取物可增強(qiáng)鯉、羅非魚的免疫力和抗病菌感染能力[13-14]。

    本研究以四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)鯉肝臟組織的急性損傷模型為基礎(chǔ),通過肝功能生化指標(biāo)和肝組織病理切片的變化來評價(jià)黃芪提取物對鯉急性肝損傷的保護(hù)作用,為開發(fā)魚類保肝中草藥配方奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 藥品和試劑

    黃芪提取物購自西安應(yīng)化生物技術(shù)有限公司,有效成分黃芪多糖含量為70%。

    谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活性、谷草轉(zhuǎn)氨酶 (GOT)活性、乳酸脫氫酶(LDH)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、總蛋白質(zhì)(TP)含量、白蛋白質(zhì)(Alb)含量、總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽(GSH)活性等測定試劑盒均購自于南京建成生物工程研究所科技有限公司。

    1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    試驗(yàn)所用魚來自于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心漁場,體質(zhì)健康無病,規(guī)格基本一致,在循環(huán)水系統(tǒng)中馴養(yǎng)5 d。

    將初重為(27.0±1.0)g鯉隨機(jī)分為6組,正常組:飼喂普通飼料(粗蛋白40%,粗脂肪10%,灰分10%,能量21 kJ/g,DM),在循環(huán)水系統(tǒng)中飼養(yǎng)60 d后,腹腔注射植物油,注射量為0.5 ml/kg;CCl4對照組:飼喂普通飼料(粗蛋白40%,粗脂肪10%,灰分10%,能量21 kJ/g,DM),在循環(huán)水系統(tǒng)中飼養(yǎng)60 d后,腹腔注射30%CCl4混合液(CCl4∶植物油=3∶7),注射量為0.5 ml/kg;藥物對照組:飼喂含3.0 g/kg黃芪提取物的飼料,在循環(huán)水系統(tǒng)中飼養(yǎng)60 d后,腹腔注射植物油,注射量為0.5 ml/kg;1.0 g/kg黃芪提取物組:飼喂含1.0 g/kg黃芪提取物的飼料,在循環(huán)水系統(tǒng)中飼養(yǎng)60 d后,腹腔注射30%的CCl4(CCl4∶植物油=3∶7),每10 g魚注射0.05 g CCl4-植物油混合液;1.5 g/kg黃芪提取物組:飼喂含1.0 g/kg黃芪提取物的飼料,在循環(huán)水系統(tǒng)中飼養(yǎng)60 d后,腹腔注射30%的CCl4(CCl4∶植物油=3∶7),每10 g魚注射0.05g CCl4-植物油混合液;3.0 g/kg黃芪提取物組:飼喂含1.0 g/kg黃芪提取物的飼料,在循環(huán)水系統(tǒng)中飼養(yǎng)60 d后,腹腔注射30%的CCl4(CCl4∶植物油=3∶7),每10 g魚注射0.05 g CCl4-植物油混合液,每組15條魚。每天飼喂2次,每次投喂飼料量為魚體重的2%左右。72 h后抽血并采集肝組織。

    1.3 肝組織勻漿制備

    將抽完血的魚進(jìn)行解剖,取其肝臟組織,用預(yù)冷的生理鹽水漂洗去血液,剪去肝臟表面附著的結(jié)締組織,再用濾紙吸去表面水分,稱重,用眼科剪刀剪碎,移入勻漿管中,加入0.86%生理鹽水進(jìn)行勻漿,生理鹽水的總體積是組織塊質(zhì)量的9倍。將制備好的10.00% 的勻漿用普通離心機(jī)2 000 r/min離心15 min收集上清液,備用。

    1.4 生化指標(biāo)活力測定與組織病理學(xué)觀察

    生化指標(biāo)活力測定:按照試劑盒操作說明分別測定血清生化參數(shù)(GPT活性、GOT活性、LDH活性、Alb含量和TP含量);肝勻漿生化參數(shù)(SOD活性、CAT活性、GSH-Px活性、T-AOC、GSH 含量和MDA含量)。

    組織病理學(xué)觀察:將采集的鯉肝組織用10.00%的甲醛固定,制作常規(guī)石蠟切片,HE染色,光鏡下觀察并拍照。

    1.5 測定指標(biāo)的計(jì)算

    特定生長率(SGR)=(lnWt-lnW0)/t×100%

    餌料系數(shù)(FC)=FI/(Wt-W0)

    肝指數(shù)(LI)=Wl/Wb×100%

    脾指數(shù)(SI)=Ws/Wb×100%

    式中,W0為魚初體均重(g);Wt為魚末體均重(g);t為飼喂天數(shù)(d);FI每尾魚平均攝食飼料總量(風(fēng)干樣重)(g);Wl為每尾魚末肝臟重 (g);Ws為每尾魚末脾臟重(g);Wb為每尾魚末體重(g)。

    1.6 數(shù)據(jù)分析

    數(shù)據(jù)分析采用SPSS16.0軟件包中的單因素方差分析(One-way-ANOVA)處理,對樣本之間進(jìn)行t檢驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1 黃芪提取物對鯉生長性能的影響

    由表1可見,用含黃芪提取物飼料飼喂鯉60 d后,隨黃芪提取物濃度的增加,鯉特定生長率有升高的趨勢,其飼料系數(shù)呈下降趨勢,但與正常組相比,2項(xiàng)指標(biāo)均未達(dá)到顯著性差異。表明黃芪提取物沒有有效地促進(jìn)鯉生長性能(P>0.05)。

    表1 黃芪提取物對鯉特定生長率和餌料系數(shù)的影響Table 1 Effects of ARE on specific growth rates and feed coefficients of carps

    2.2 黃芪提取物對鯉肝和脾指數(shù)的影響

    由表2可知,CCl4對照組鯉肝指數(shù)和脾指數(shù)顯著高于正常組(P <0.05),而在1.0 g/kg、1.5 g/kg、3.0 g/kg黃芪提取物中這2種指數(shù)均低于CCl4對照組,其中3.0 g/kg黃芪提取物組中肝指數(shù)和脾指數(shù)顯著低于CCl4對照組(P<0.05)。

    表2 黃芪提取物對CCl4致鯉肝和脾指數(shù)的影響Table 2 Effects of ARE on liver and spleen indexes of CCl4-treated carps

    2.3 黃芪提取物對鯉血清中生化指標(biāo)的影響

    圖1結(jié)果顯示,CCl4對照組鯉血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)和乳酸脫氫酶(LDH)活性均顯著或極顯著高于正常組(P<0.01或P<0.05),GPT升高4倍左右,GOT升高3倍左右,表明CCl4嚴(yán)重?fù)p傷鯉肝組織。相對于 CCl4組,1.5 g/kg和3.0 g/kg黃芪提取物組鯉血清中GPT、GOT和LDH活性均顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)。與正常組相比較,CCl4對照組鯉血清中總蛋白質(zhì)(TP)含量顯著下降(P<0.05),白蛋白質(zhì)(Alb)含量極顯著下降(P<0.01)。1.5 g/kg和3.0 g/kg黃芪提取物組鯉血清中TP和Alb含量均顯著高于CCl4對照組(P<0.05)。

    圖1 黃芪提取物對CCl4致鯉肝損傷血清中GPT活性、GOT活性、LDH活性、總蛋白質(zhì)含量和白蛋白質(zhì)含量的影響Fig.1 Effects of ARE on the activities of GPT,GOT and LDH and the contents of TP and Albumin in the serum of CCl4-treated carps

    2.4 黃芪提取物對鯉肝組織勻漿中生化指標(biāo)的影響

    CCl4對照組鯉肝組織抗氧化指標(biāo)[超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、過氧化氫酶(CAT)活性、和總抗氧化能力(TAOC)]均顯著低于正常組(P<0.05)(圖2),表明CCl4顯著地破壞了鯉肝組織中的抗氧化系統(tǒng)。1.0 g/kg、1.5 g/kg和3.0 g/kg黃芪提取物組SOD活性、GSH-Px活性、CAT活性和T-AOC均不同程度地高于CCl4對照組,其中1.5 g/kg和3.0 g/kg黃芪提取物組SOD活性和T-AOC均顯著高于CCl4對照組(P<0.05),3.0 g/kg黃芪提取物組GSH-Px和CAT均顯著高于CCl4對照組(P<0.05)(圖2)。

    與正常組相比,CCl4對照組鯉肝組織谷胱甘肽(GSH)含量顯著下降(P<0.05),丙二醛(MDA)含量顯著增加(P<0.05)(圖2)。1.5 g/kg和 3.0 g/kg黃芪提取物組GSH含量顯著高于CCl4對照組(P<0.05);3.0 g/kg黃芪提取物組MDA含量顯著低于CCl4對照組(P<0.05)。

    圖2 黃芪提取物對CCl4致鯉肝損傷組織中SOD活性、GSH-Px活性、CAT活性、總抗氧化能力、GSH含量和MDA含量的影響Fig.2 Effects of ARE on the activities of SOD,GSH-Px,CAT,and the contents of T-AOC,CSH and MDA in the liver of CCl4-treated carps

    2.5 黃芪提取物對鯉肝組織形態(tài)學(xué)的影響

    由圖3可知,正常組鯉肝細(xì)胞輪廓清晰,細(xì)胞大小基本一致,細(xì)胞核突出、呈球形、位于細(xì)胞中央,并且能觀察到細(xì)胞核中的核仁;CCl4對照組鯉肝細(xì)胞中細(xì)胞核變小、固縮、側(cè)移,有的細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核消失,出現(xiàn)空泡,細(xì)胞之間發(fā)生融合;飼喂黃芪提取物的肝組織切片中保護(hù)程度和其濃度相關(guān),在1.0 g/kg黃芪提取物組中,有很多細(xì)胞之間發(fā)生融合,細(xì)胞核變小、側(cè)移,空泡較多;1.5 g/kg黃芪提取物組中,細(xì)胞肝損傷程度變小,細(xì)胞數(shù)量增多,空泡減少,細(xì)胞形態(tài)多為圓形,細(xì)胞膜清晰可見;而在3.0 g/kg黃芪提取物組中,其損傷程度明顯降低,細(xì)胞核位于細(xì)胞中心,細(xì)胞與細(xì)胞之間的邊界清晰可見。

    圖3 黃芪提取物對鯉肝組織損傷的影響(HE染色,×200)Fig.3 Effects of ARE on carp liver injury induced by CCl4

    3 討論

    四氯化碳(CCl4)是一種經(jīng)典的肝臟毒物,被廣泛的用來構(gòu)建肝(細(xì)胞)損傷模型來研究肝損傷機(jī)理和篩選保肝藥物[7,15]。CCl4在肝細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過代謝產(chǎn)生·CCl3自由基,作用于細(xì)胞后,和膜上的不飽和脂質(zhì)共價(jià)結(jié)合,致使脂質(zhì)過氧化,引起肝細(xì)胞的壞死[16],其機(jī)理為:CC14經(jīng) CYP450 亞族 CYP450 2E1活化后生成三氯甲基自由基(·CC13),并在其啟動(dòng)的過氧化連鎖反應(yīng)中,產(chǎn)生毒性作用更強(qiáng)的二氯甲基自由基 (·CC12)及過氧化甲基自由基(·OOCC1)[17]。與哺乳動(dòng)物一樣,魚類肝細(xì)胞對CCl4也比較敏感[18],對虹鱒的研究結(jié)果表明,CCl4致使肝組織損傷,引起LDH大量的釋放和GSH含量的降低,并且這些變化呈劑量依賴性[19]。進(jìn)一步研究結(jié)果表明CCl4會(huì)抑制肝組織和腎組織中抗氧化酶基因的表達(dá)[20]。

    本研究結(jié)果顯示,黃芪提取物對鯉肝組織沒有毒性作用。當(dāng)鯉腹部注射CCl4后,肝臟和脾臟直接暴露在毒物中,CCl4形成的自由基嚴(yán)重地?fù)p傷了鯉肝組織和脾組織,導(dǎo)致其水腫和局部腐爛,因此肝指數(shù)和脾指數(shù)顯著高于正常組。用黃芪提取物飼喂的鯉肝指數(shù)和脾指數(shù)均低于CCl4組,當(dāng)黃芪提取物濃度到達(dá)3.0 g/kg時(shí),肝指數(shù)和脾指數(shù)顯著降低,表明黃芪提取物有效地抑制了CCl4引起的鯉肝組織損傷。

    肝細(xì)胞受到損傷后,細(xì)胞膜通透性增強(qiáng),細(xì)胞內(nèi)的可溶性酶GPT、GOT和LDH溢出量顯著增高[21]。這3種酶是肝細(xì)胞是否損傷的經(jīng)典指標(biāo),是存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)的可溶性酶,其活性變化亦是反映肝細(xì)胞受損傷的主要敏感指標(biāo)[22]。本試驗(yàn)中,CCl4組鯉肝組織中GPT、GOT和LDH活性顯著高于正常組;飼喂黃芪提取物組鯉肝組織GPT、GOT和LDH活性均顯著低于CCl4組,而TP和Alb含量均顯著高于CCl4組。Yan等[23]在對小鼠的研究中也發(fā)現(xiàn),黃芪提取物能抑制肝損傷。據(jù)推測這可能與黃芪提取物中多糖對細(xì)胞膜修復(fù)作用相關(guān)[24]。

    脂質(zhì)過氧化是機(jī)體氧化應(yīng)激的重要指標(biāo),MDA是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物,其含量的高低可反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度[21]。CCl4做為一種肝臟毒物可促進(jìn)組織中自由基的增長和脂質(zhì)過氧化[25],引起MDA含量的升高;段薈等[26]研究結(jié)果顯示,黃芪提取物可抑制MDA的上升,提示黃芪提取物同時(shí)可通過抑制自由基和脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生,而起到對肝損傷細(xì)胞的保護(hù)作用。本試驗(yàn)中,CCl4組鯉肝組織MDA含量顯著增加,而在黃芪提取物組中MDA生成被不同程度地抑制,其中3.0 g/kg黃芪提取物組MDA含量顯著降低,表明黃芪提取物能有效抑制鯉肝組織脂質(zhì)過氧化。

    研究結(jié)果表明,藥物保肝作用主要與其抗氧化能力和清除自由基能力有關(guān)[27]。機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)(SOD、GSH-Px、CAT)為防自由基損傷的第一道防線,這些酶活性的降低表明自由基含量的升高[28];T-AOC反應(yīng)了機(jī)體防御體系的抗氧化能力的強(qiáng)弱,包含了酶促和非酶促2個(gè)抗氧化反應(yīng)體系,是機(jī)體抗氧化物質(zhì)含量高低的可靠指標(biāo)[29]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,CCl4致使鯉肝組織損傷,引起SOD活性、GSH-Px活性、CAT活性和T-AOC降低,而用黃芪提取物飼喂后的鯉肝中4種生化指標(biāo)均提高,表明黃芪提取物能增強(qiáng)鯉抗氧化能力。同樣,Shen等[30]也發(fā)現(xiàn)黃芪提取物能提高小鼠體內(nèi)SOD活性。有研究發(fā)現(xiàn)黃芪提取物中黃芪多糖能夠增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力,提高清除自由基的能力[12]。

    GSH是一種生物體內(nèi)最豐富的三肽非酶類抗氧化物,可直接消除活性氧自由基,同時(shí)作為谷胱甘肽過氧化物酶的底物,在清除細(xì)胞內(nèi)過氧化氫及脂過氧化物中發(fā)揮作用[31]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,CCl4引起鯉肝組織中GSH大量的消耗,而黃芪提取物顯著抑制GSH的消耗。在對小鼠研究中發(fā)現(xiàn),黃芪提取物能增強(qiáng)機(jī)體GSH含量[26],這與本研究結(jié)果相符。

    本研究結(jié)果顯示,黃芪提取物對鯉肝組織的保護(hù)效果呈劑量依賴性,3.0 g/kg黃芪提取物的保護(hù)效果最好。從本研究結(jié)果推測,黃芪提取物對鯉肝組織的保護(hù)作用與其增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力、促進(jìn)蛋白合成、抑制GSH消耗和MDA生成等有關(guān)。

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