黃芪提取物對(duì)鯉急性肝組織損傷的保護(hù)作用

賈 睿， 杜金梁， 曹麗萍， 徐 跑， 殷國(guó)俊

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214081)

近年來(lái)，魚類肝膽綜合癥、脂肪性肝損傷、化學(xué)性肝損傷等疾病在全國(guó)很多地區(qū)頻繁發(fā)生，給水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來(lái)了極大的經(jīng)濟(jì)損失［1-2］。這些疾病的病因多樣，但都破壞肝細(xì)胞的正常功能，導(dǎo)致肝細(xì)胞破裂，肝組織發(fā)生病變，肝臟功能下降，最終導(dǎo)致魚類的死亡［3］。目前還沒(méi)有有效的防治措施。中草藥在水產(chǎn)動(dòng)物病害防治中的研究已經(jīng)非常廣泛，漁業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐證明，中草藥作為混和劑或飼料添加劑適用于當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的集約化、規(guī)?；a(chǎn)的需要［4］。中草藥制劑在草魚、鰻魚、鱘魚、甲魚等的腸炎防治、免疫力提高中有顯著療效［5］。有研究發(fā)現(xiàn)，有些中草藥提取物對(duì)肝膽綜合癥，化學(xué)性肝損傷有一定的治療作用［6-7］。中草藥為天然藥物，毒副作用小，對(duì)環(huán)境影響小，不宜在魚體內(nèi)富集，符合現(xiàn)代人的綠色消費(fèi)。因此中草藥在水產(chǎn)動(dòng)物肝損傷防治中的應(yīng)用將逐漸擴(kuò)大。

黃芪為豆科紫云英膜莢黃芪及內(nèi)蒙黃芪的根。廣泛分布于世界溫帶地區(qū)，主要為歐洲、亞洲、南美洲等地。黃芪多糖(APS)為黃芪中主要藥用活性成分，其組成為鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖。在哺乳動(dòng)物中，黃芪提取物被廣泛的研究，其可提高動(dòng)物免疫力、改善肝細(xì)胞的功能、具有保肝和抗氧化等作用［8-12］。在水產(chǎn)動(dòng)物中，黃芪提取物可增強(qiáng)鯉、羅非魚的免疫力和抗病菌感染能力［13-14］。

本研究以四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)鯉肝臟組織的急性損傷模型為基礎(chǔ)，通過(guò)肝功能生化指標(biāo)和肝組織病理切片的變化來(lái)評(píng)價(jià)黃芪提取物對(duì)鯉急性肝損傷的保護(hù)作用，為開(kāi)發(fā)魚類保肝中草藥配方奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑

黃芪提取物購(gòu)自西安應(yīng)化生物技術(shù)有限公司，有效成分黃芪多糖含量為70%。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)活性、谷草轉(zhuǎn)氨酶 (GOT)活性、乳酸脫氫酶(LDH)活性、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、總蛋白質(zhì)(TP)含量、白蛋白質(zhì)(Alb)含量、總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽(GSH)活性等測(cè)定試劑盒均購(gòu)自于南京建成生物工程研究所科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)所用魚來(lái)自于中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心漁場(chǎng)，體質(zhì)健康無(wú)病，規(guī)格基本一致，在循環(huán)水系統(tǒng)中馴養(yǎng)5 d。

將初重為(27.0±1.0)g鯉隨機(jī)分為6組，正常組:飼喂普通飼料(粗蛋白40%，粗脂肪10%，灰分10%，能量21 kJ/g，DM)，在循環(huán)水系統(tǒng)中飼養(yǎng)60 d后，腹腔注射植物油，注射量為0.5 ml/kg;CCl4對(duì)照組:飼喂普通飼料(粗蛋白40%，粗脂肪10%，灰分10%，能量21 kJ/g，DM)，在循環(huán)水系統(tǒng)中飼養(yǎng)60 d后，腹腔注射30%CCl4混合液(CCl4∶植物油=3∶7)，注射量為0.5 ml/kg;藥物對(duì)照組:飼喂含3.0 g/kg黃芪提取物的飼料，在循環(huán)水系統(tǒng)中飼養(yǎng)60 d后，腹腔注射植物油，注射量為0.5 ml/kg;1.0 g/kg黃芪提取物組:飼喂含1.0 g/kg黃芪提取物的飼料，在循環(huán)水系統(tǒng)中飼養(yǎng)60 d后，腹腔注射30%的CCl4(CCl4∶植物油=3∶7)，每10 g魚注射0.05 g CCl4-植物油混合液;1.5 g/kg黃芪提取物組:飼喂含1.0 g/kg黃芪提取物的飼料，在循環(huán)水系統(tǒng)中飼養(yǎng)60 d后，腹腔注射30%的CCl4(CCl4∶植物油=3∶7)，每10 g魚注射0.05g CCl4-植物油混合液;3.0 g/kg黃芪提取物組:飼喂含1.0 g/kg黃芪提取物的飼料，在循環(huán)水系統(tǒng)中飼養(yǎng)60 d后，腹腔注射30%的CCl4(CCl4∶植物油=3∶7)，每10 g魚注射0.05 g CCl4-植物油混合液，每組15條魚。每天飼喂2次，每次投喂飼料量為魚體重的2%左右。72 h后抽血并采集肝組織。

1.3 肝組織勻漿制備

將抽完血的魚進(jìn)行解剖，取其肝臟組織，用預(yù)冷的生理鹽水漂洗去血液，剪去肝臟表面附著的結(jié)締組織，再用濾紙吸去表面水分，稱重，用眼科剪刀剪碎，移入勻漿管中，加入0.86%生理鹽水進(jìn)行勻漿，生理鹽水的總體積是組織塊質(zhì)量的9倍。將制備好的10.00% 的勻漿用普通離心機(jī)2 000 r/min離心15 min收集上清液，備用。

1.4 生化指標(biāo)活力測(cè)定與組織病理學(xué)觀察

生化指標(biāo)活力測(cè)定:按照試劑盒操作說(shuō)明分別測(cè)定血清生化參數(shù)(GPT活性、GOT活性、LDH活性、Alb含量和TP含量);肝勻漿生化參數(shù)(SOD活性、CAT活性、GSH-Px活性、T-AOC、GSH 含量和MDA含量)。

組織病理學(xué)觀察:將采集的鯉肝組織用10.00%的甲醛固定，制作常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察并拍照。

1.5 測(cè)定指標(biāo)的計(jì)算

特定生長(zhǎng)率(SGR)=(lnWt－lnW0)/t×100%

餌料系數(shù)(FC)=FI/(Wt-W0)

肝指數(shù)(LI)=Wl/Wb×100%

脾指數(shù)(SI)=Ws/Wb×100%

式中，W0為魚初體均重(g);Wt為魚末體均重(g);t為飼喂天數(shù)(d);FI每尾魚平均攝食飼料總量(風(fēng)干樣重)(g);Wl為每尾魚末肝臟重 (g);Ws為每尾魚末脾臟重(g);Wb為每尾魚末體重(g)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用SPSS16.0軟件包中的單因素方差分析(One-way-ANOVA)處理，對(duì)樣本之間進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 黃芪提取物對(duì)鯉生長(zhǎng)性能的影響

由表1可見(jiàn)，用含黃芪提取物飼料飼喂鯉60 d后，隨黃芪提取物濃度的增加，鯉特定生長(zhǎng)率有升高的趨勢(shì)，其飼料系數(shù)呈下降趨勢(shì)，但與正常組相比，2項(xiàng)指標(biāo)均未達(dá)到顯著性差異。表明黃芪提取物沒(méi)有有效地促進(jìn)鯉生長(zhǎng)性能(P＞0.05)。

表1 黃芪提取物對(duì)鯉特定生長(zhǎng)率和餌料系數(shù)的影響Table 1 Effects of ARE on specific growth rates and feed coefficients of carps

2.2 黃芪提取物對(duì)鯉肝和脾指數(shù)的影響

由表2可知，CCl4對(duì)照組鯉肝指數(shù)和脾指數(shù)顯著高于正常組(P ＜0.05)，而在1.0 g/kg、1.5 g/kg、3.0 g/kg黃芪提取物中這2種指數(shù)均低于CCl4對(duì)照組，其中3.0 g/kg黃芪提取物組中肝指數(shù)和脾指數(shù)顯著低于CCl4對(duì)照組(P＜0.05)。

表2 黃芪提取物對(duì)CCl4致鯉肝和脾指數(shù)的影響Table 2 Effects of ARE on liver and spleen indexes of CCl4-treated carps

2.3 黃芪提取物對(duì)鯉血清中生化指標(biāo)的影響

圖1結(jié)果顯示，CCl4對(duì)照組鯉血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)和乳酸脫氫酶(LDH)活性均顯著或極顯著高于正常組(P＜0.01或P＜0.05)，GPT升高4倍左右，GOT升高3倍左右，表明CCl4嚴(yán)重?fù)p傷鯉肝組織。相對(duì)于 CCl4組，1.5 g/kg和3.0 g/kg黃芪提取物組鯉血清中GPT、GOT和LDH活性均顯著或極顯著降低(P＜0.05或P＜0.01)。與正常組相比較，CCl4對(duì)照組鯉血清中總蛋白質(zhì)(TP)含量顯著下降(P＜0.05)，白蛋白質(zhì)(Alb)含量極顯著下降(P＜0.01)。1.5 g/kg和3.0 g/kg黃芪提取物組鯉血清中TP和Alb含量均顯著高于CCl4對(duì)照組(P＜0.05)。

圖1 黃芪提取物對(duì)CCl4致鯉肝損傷血清中GPT活性、GOT活性、LDH活性、總蛋白質(zhì)含量和白蛋白質(zhì)含量的影響Fig.1 Effects of ARE on the activities of GPT，GOT and LDH and the contents of TP and Albumin in the serum of CCl4-treated carps

2.4 黃芪提取物對(duì)鯉肝組織勻漿中生化指標(biāo)的影響

CCl4對(duì)照組鯉肝組織抗氧化指標(biāo)［超氧化物歧化酶(SOD)活性、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性、過(guò)氧化氫酶(CAT)活性、和總抗氧化能力(TAOC)］均顯著低于正常組(P＜0.05)(圖2)，表明CCl4顯著地破壞了鯉肝組織中的抗氧化系統(tǒng)。1.0 g/kg、1.5 g/kg和3.0 g/kg黃芪提取物組SOD活性、GSH-Px活性、CAT活性和T-AOC均不同程度地高于CCl4對(duì)照組，其中1.5 g/kg和3.0 g/kg黃芪提取物組SOD活性和T-AOC均顯著高于CCl4對(duì)照組(P＜0.05)，3.0 g/kg黃芪提取物組GSH-Px和CAT均顯著高于CCl4對(duì)照組(P＜0.05)(圖2)。

與正常組相比，CCl4對(duì)照組鯉肝組織谷胱甘肽(GSH)含量顯著下降(P＜0.05)，丙二醛(MDA)含量顯著增加(P＜0.05)(圖2)。1.5 g/kg和 3.0 g/kg黃芪提取物組GSH含量顯著高于CCl4對(duì)照組(P＜0.05);3.0 g/kg黃芪提取物組MDA含量顯著低于CCl4對(duì)照組(P＜0.05)。

圖2 黃芪提取物對(duì)CCl4致鯉肝損傷組織中SOD活性、GSH-Px活性、CAT活性、總抗氧化能力、GSH含量和MDA含量的影響Fig.2 Effects of ARE on the activities of SOD，GSH-Px，CAT，and the contents of T-AOC，CSH and MDA in the liver of CCl4-treated carps

2.5 黃芪提取物對(duì)鯉肝組織形態(tài)學(xué)的影響

由圖3可知，正常組鯉肝細(xì)胞輪廓清晰，細(xì)胞大小基本一致，細(xì)胞核突出、呈球形、位于細(xì)胞中央，并且能觀察到細(xì)胞核中的核仁;CCl4對(duì)照組鯉肝細(xì)胞中細(xì)胞核變小、固縮、側(cè)移，有的細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞核消失，出現(xiàn)空泡，細(xì)胞之間發(fā)生融合;飼喂黃芪提取物的肝組織切片中保護(hù)程度和其濃度相關(guān)，在1.0 g/kg黃芪提取物組中，有很多細(xì)胞之間發(fā)生融合，細(xì)胞核變小、側(cè)移，空泡較多;1.5 g/kg黃芪提取物組中，細(xì)胞肝損傷程度變小，細(xì)胞數(shù)量增多，空泡減少，細(xì)胞形態(tài)多為圓形，細(xì)胞膜清晰可見(jiàn);而在3.0 g/kg黃芪提取物組中，其損傷程度明顯降低，細(xì)胞核位于細(xì)胞中心，細(xì)胞與細(xì)胞之間的邊界清晰可見(jiàn)。

圖3 黃芪提取物對(duì)鯉肝組織損傷的影響(HE染色，×200)Fig.3 Effects of ARE on carp liver injury induced by CCl4

3 討論

四氯化碳(CCl4)是一種經(jīng)典的肝臟毒物，被廣泛的用來(lái)構(gòu)建肝(細(xì)胞)損傷模型來(lái)研究肝損傷機(jī)理和篩選保肝藥物［7，15］。CCl4在肝細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過(guò)代謝產(chǎn)生·CCl3自由基，作用于細(xì)胞后，和膜上的不飽和脂質(zhì)共價(jià)結(jié)合，致使脂質(zhì)過(guò)氧化，引起肝細(xì)胞的壞死［16］，其機(jī)理為:CC14經(jīng) CYP450 亞族 CYP450 2E1活化后生成三氯甲基自由基(·CC13)，并在其啟動(dòng)的過(guò)氧化連鎖反應(yīng)中，產(chǎn)生毒性作用更強(qiáng)的二氯甲基自由基 (·CC12)及過(guò)氧化甲基自由基(·OOCC1)［17］。與哺乳動(dòng)物一樣，魚類肝細(xì)胞對(duì)CCl4也比較敏感［18］，對(duì)虹鱒的研究結(jié)果表明，CCl4致使肝組織損傷，引起LDH大量的釋放和GSH含量的降低，并且這些變化呈劑量依賴性［19］。進(jìn)一步研究結(jié)果表明CCl4會(huì)抑制肝組織和腎組織中抗氧化酶基因的表達(dá)［20］。

本研究結(jié)果顯示，黃芪提取物對(duì)鯉肝組織沒(méi)有毒性作用。當(dāng)鯉腹部注射CCl4后，肝臟和脾臟直接暴露在毒物中，CCl4形成的自由基嚴(yán)重地?fù)p傷了鯉肝組織和脾組織，導(dǎo)致其水腫和局部腐爛，因此肝指數(shù)和脾指數(shù)顯著高于正常組。用黃芪提取物飼喂的鯉肝指數(shù)和脾指數(shù)均低于CCl4組，當(dāng)黃芪提取物濃度到達(dá)3.0 g/kg時(shí)，肝指數(shù)和脾指數(shù)顯著降低，表明黃芪提取物有效地抑制了CCl4引起的鯉肝組織損傷。

肝細(xì)胞受到損傷后，細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)的可溶性酶GPT、GOT和LDH溢出量顯著增高［21］。這3種酶是肝細(xì)胞是否損傷的經(jīng)典指標(biāo)，是存在于肝細(xì)胞漿內(nèi)的可溶性酶，其活性變化亦是反映肝細(xì)胞受損傷的主要敏感指標(biāo)［22］。本試驗(yàn)中，CCl4組鯉肝組織中GPT、GOT和LDH活性顯著高于正常組;飼喂黃芪提取物組鯉肝組織GPT、GOT和LDH活性均顯著低于CCl4組，而TP和Alb含量均顯著高于CCl4組。Yan等［23］在對(duì)小鼠的研究中也發(fā)現(xiàn)，黃芪提取物能抑制肝損傷。據(jù)推測(cè)這可能與黃芪提取物中多糖對(duì)細(xì)胞膜修復(fù)作用相關(guān)［24］。

脂質(zhì)過(guò)氧化是機(jī)體氧化應(yīng)激的重要指標(biāo)，MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的主要產(chǎn)物，其含量的高低可反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化程度［21］。CCl4做為一種肝臟毒物可促進(jìn)組織中自由基的增長(zhǎng)和脂質(zhì)過(guò)氧化［25］，引起MDA含量的升高;段薈等［26］研究結(jié)果顯示，黃芪提取物可抑制MDA的上升，提示黃芪提取物同時(shí)可通過(guò)抑制自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化物的產(chǎn)生，而起到對(duì)肝損傷細(xì)胞的保護(hù)作用。本試驗(yàn)中，CCl4組鯉肝組織MDA含量顯著增加，而在黃芪提取物組中MDA生成被不同程度地抑制，其中3.0 g/kg黃芪提取物組MDA含量顯著降低，表明黃芪提取物能有效抑制鯉肝組織脂質(zhì)過(guò)氧化。

研究結(jié)果表明，藥物保肝作用主要與其抗氧化能力和清除自由基能力有關(guān)［27］。機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)(SOD、GSH-Px、CAT)為防自由基損傷的第一道防線，這些酶活性的降低表明自由基含量的升高［28］;T-AOC反應(yīng)了機(jī)體防御體系的抗氧化能力的強(qiáng)弱，包含了酶促和非酶促2個(gè)抗氧化反應(yīng)體系，是機(jī)體抗氧化物質(zhì)含量高低的可靠指標(biāo)［29］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，CCl4致使鯉肝組織損傷，引起SOD活性、GSH-Px活性、CAT活性和T-AOC降低，而用黃芪提取物飼喂后的鯉肝中4種生化指標(biāo)均提高，表明黃芪提取物能增強(qiáng)鯉抗氧化能力。同樣，Shen等［30］也發(fā)現(xiàn)黃芪提取物能提高小鼠體內(nèi)SOD活性。有研究發(fā)現(xiàn)黃芪提取物中黃芪多糖能夠增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力，提高清除自由基的能力［12］。

GSH是一種生物體內(nèi)最豐富的三肽非酶類抗氧化物，可直接消除活性氧自由基，同時(shí)作為谷胱甘肽過(guò)氧化物酶的底物，在清除細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫及脂過(guò)氧化物中發(fā)揮作用［31］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，CCl4引起鯉肝組織中GSH大量的消耗，而黃芪提取物顯著抑制GSH的消耗。在對(duì)小鼠研究中發(fā)現(xiàn)，黃芪提取物能增強(qiáng)機(jī)體GSH含量［26］，這與本研究結(jié)果相符。

本研究結(jié)果顯示，黃芪提取物對(duì)鯉肝組織的保護(hù)效果呈劑量依賴性，3.0 g/kg黃芪提取物的保護(hù)效果最好。從本研究結(jié)果推測(cè)，黃芪提取物對(duì)鯉肝組織的保護(hù)作用與其增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化能力、促進(jìn)蛋白合成、抑制GSH消耗和MDA生成等有關(guān)。

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