玉米赤霉烯酮殘留檢測ELISA試劑盒的研制

萬宇平， 韓 黎， 吳 鵬， 馮才偉， 趙靜雅， 李 勇

(1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206;2.解放軍疾病預(yù)防控制所，北京 100071)

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)，又稱F-2雌性發(fā)情激素，分子式 C18H22O5，相對分子量 318［1］。ZEN的熔點為161～163℃，在食品或飼料加工過程中均不易破壞［2］。ZEN是由禾谷鐮刀菌等菌種產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，主要污染玉米、大麥、小麥等作物，在世界各地糧谷與飼料中均有存在，其具有較強生殖毒性和致畸作用，可引起動物發(fā)生雌激素亢進癥，導(dǎo)致動物不孕或流產(chǎn)，給畜牧業(yè)帶來很大的經(jīng)濟損失［3-4］。此外，ZEN還具有細(xì)胞毒性、免疫毒性、肝毒性、潛在致癌性等，最新研究結(jié)果顯示其對女性乳腺腫瘤發(fā)生也有一定影響［5-6］。法國、意大利、德國、巴西、俄羅斯、加拿大等國家均已制定了ZEN在飼料及糧食谷物中的最大含量(50～250 μg/kg)［7-8］。中國規(guī)定小麥、玉米中 ZEN含量不得超過 0.06 mg/kg［9］。

目前ZEN的檢測方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層層析法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法以及酶聯(lián)免疫法等［10］。酶聯(lián)免疫法近幾年發(fā)展迅速，其中張曉等［7］運用間接競爭酶聯(lián)免疫法測定動物飼料中ZEN含量，其最低檢出限為0.1 μg/kg，該法檢測回收率范圍為67.0%～99.0%;王玉平等［11］研制了ZEN ELISA快速檢測試劑盒，該試劑盒最低檢出濃度為10.0 μg/kg，對玉米和小麥平均加標(biāo)回收率分別是96.5% 和95.5%;劉濤等［12］利用直接競爭酶聯(lián)免疫法檢測大麥中ZEN含量，最低檢出限為4.0 μg/kg，樣品加標(biāo)回收率為73.3% ～96.7%。王雄等［13］研發(fā)了間接競爭ELISA試劑盒，最低檢出質(zhì)量濃度為10.0 μg/kg，對玉米和小麥的平均添加回收率分別是92.5%和91.7%;王元凱等［14］建立的間接競爭酶聯(lián)免疫試劑盒最低檢出濃度為1.0 μg/L，對玉米和小麥的平均加標(biāo)回收率分別是96.5%和95.5%。這些研究還僅僅停留在研究階段，沒有進行試劑盒的市場化，本研究擬合成ZEN的半抗原并進一步制備出抗原，最終得到抗ZEN的單克隆抗體，試圖建立飼料中ZEN殘留的酶聯(lián)免疫檢測方法，為ZEN試劑盒的推廣奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

ZEN、鹽酸羥胺、吡啶、四氫呋喃、琥珀酸酐、氯甲酸異丁酯、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)等生化試劑均購自上海華美公司，碳酸鈉、二甲基甲酰胺、戊二醛等生化試劑均購自北京陸橋有限責(zé)任公司。

1.2 儀器

酶標(biāo)儀MK3、微量移液器購自美國Thermo公司;氮吹儀KL512購自美國Organomation公司;磁力攪拌器90-2購自上海振榮科學(xué)儀器有限公司;低速離心機Anke TDL-40B購自上海安亭科學(xué)儀器有限公司;電子天平2000SBL購自美國Setra公司;生化培養(yǎng)箱DHP-600購自天津市中環(huán)實驗電爐有限公司。

1.3 方法

1.3.1 半抗原制備 將ZEN與鹽酸羥胺縮合反應(yīng)，引入一個新的羥基，再與琥珀酸酐反應(yīng)得到具有羧基官能團的半抗原。半抗原的具體步驟:159 mg ZEN與鹽酸羥胺在5.0 ml吡啶溶液中室溫攪拌12～24 h，旋蒸除去吡啶和未反應(yīng)的羥胺，得到粗產(chǎn)物，加入5.0 ml四氫呋喃和200 μl吡啶，室溫攪拌0.5 h，滴加溶于1.0 ml四氫呋喃溶液中的50 mg琥珀酸酐，室溫反應(yīng)12～24 h，旋蒸除去溶劑和吡啶，柱層析純化，得到ZEN半抗原。

1.3.2 免疫原制備 將ZEN半抗原與BSA進行偶聯(lián)得到免疫原。具體操如下:取ZEN半抗原8 mg用1.0 ml二甲基甲酰胺(DMF)溶解，取氯甲酸異丁酯8 μl加入，10℃攪拌反應(yīng)30 min，即可得到反應(yīng)液A;稱取BSA 60 mg，使之充分溶解在2.0 ml 50 mmol/L碳酸鈉溶液中得B液;將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到反應(yīng)液B中，10℃反應(yīng)4 h，然后4℃過夜;用0.01 mol/L PBS透析3 d，每天換3次透析液。分裝，于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 包被原制備 將ZEN半抗原與OVA偶聯(lián)得到包被原。具體操作如下:取ZEN半抗原5 mg用1.0 ml DMF溶解，取氯甲酸異丁酯5 μl加入，10℃攪拌反應(yīng)30 min，即可得到反應(yīng)液A;稱取OVA 30 mg，使之充分溶解在2.0 ml 50 mmol/L碳酸鈉溶液中得B液;將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到反應(yīng)液B中，10℃反應(yīng)4 h，然后4℃過夜;用0.01 mol/L PBS透析3 d，每天換3次透析液。分裝，于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 抗體制備 將ZEN-BSA與等量福氏佐劑混合后，以皮下多點注射方式免疫Balb/c小鼠;免疫4次后摘取小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，并篩選陽性細(xì)胞株;對篩選出的陽性細(xì)胞株亞克隆，純化后進行擴增;用擴增后的陽性骨髓瘤細(xì)胞對Balb/c小鼠進行腹腔注射，7 d后收集腹腔液，純化后即可得ZEN單克隆抗體。

1.3.5 ELISA 檢測方法的建立

1.3.5.1 酶標(biāo)板制備 用包被液將包被原稀釋到適當(dāng)濃度加入酶標(biāo)板中，1孔100 μl;37℃孵育2 h，倒掉余液，用洗滌工作液洗滌1次;加入封閉液1孔150 μl，37 ℃孵育 2 h，甩掉其中溶液，拍干。

1.3.5.2 酶標(biāo)抗體制備 將10 mg酶溶于0.2 ml含1.25%戊二醛的0.10 mol/L pH6.8 PBS中室溫放置18 h，充分透析或以SephadexG25柱除去未反應(yīng)的戊二醛。加生理鹽水至1.0 ml然后加入1.0 ml(含5 mg)抗體溶液和1.0 ml 1.00 mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液，混合后4℃冰箱放置24 h，加入0.1 ml 0.20 mol/L賴氨酸，置室溫 2 h，以 0.15 mol/L pH7.2 PBS液充分透析，離心去沉淀，上清液即為酶結(jié)合物，再進一步以硫酸銨沉淀純化后應(yīng)用。

1.3.5.3 底物液制備 由A液和B液組成，A液配方為取1 g過氧化脲，10.3 g檸檬酸，35.8 g Na2HPO4·12H2O，100 μl吐溫 －20 溶于去離子水，調(diào)至pH=5.0，并最終定容至1 000 ml;B液配方為取700 mg四甲基聯(lián)苯胺，10.3 g檸檬酸溶于去離子水，調(diào)至pH值=2.6，并最終定容至1 000 ml。

1.3.5.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 向包被有ZEN抗原的酶標(biāo)板中加入1孔20 μl的樣品溶液或ZEN標(biāo)準(zhǔn)溶液(濃度為 0 μg/ml、5.0 μg/ml、15.0 μg/ml、45.0 μg/ml、135.0 μg/ml、405.0 μg/ml)，并加入 1 孔100 μl的酶標(biāo)抗體工作液，振蕩混勻后于25℃避光環(huán)境中反應(yīng)10 min。洗滌5次后拍干，加入底物A液、B液1孔各50 μl，反應(yīng)5 min后用濃度為2.00 mol/L的濃硫酸1孔50 μl終止，并用酶標(biāo)儀檢測光密度值(OD)，根據(jù)百分吸光度值和標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 飼料樣品的處理 用均質(zhì)器均質(zhì)飼料樣本;稱取(5.00±0.05)g飼料樣本至50.0 ml聚苯乙烯離心管中，加入25.0 ml 50%甲醇，用振蕩器劇烈振蕩5 min，3 000 g以上，室溫(20～25 ℃)離心5 min;取500 μl上清液至2.0 ml聚苯乙烯離心管中，加入500 μl 10%氯化鈉水溶液混合均勻;取20 μl用于分析。

1.3.7 試劑盒指標(biāo)的檢測 分別對研制的ZEN試劑盒進行交叉反應(yīng)率檢測、檢測限檢測、準(zhǔn)確度和精密度檢測以及穩(wěn)定性檢測。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線呈典型的 S型，線性回歸方程為:Y= －2.102 6x+2.744 0，相關(guān)系數(shù) r=0.990 0。根據(jù)回歸方程計算出IC50濃度為25.1 μg/L，試劑盒的線性檢測范圍為 5.0 ～405.0 μg/L。

2.2 交叉反應(yīng)率

選擇在結(jié)構(gòu)上和玉米赤霉烯酮類似的化合物玉米赤霉酮、α-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉醇、β-玉米赤霉烯醇作為標(biāo)準(zhǔn)品進行反應(yīng)，檢測交叉反應(yīng)率。結(jié)果(表1)顯示，試劑盒對玉米赤霉烯酮、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉醇的交叉反應(yīng)率均較高。

表1 交叉反應(yīng)率Table 1 Results of crossreactivity

2.3 最低檢測限

按照國際標(biāo)準(zhǔn)計算篩選法的最低檢測限，檢測陰性飼料樣品20份，計算其實測濃度平均值，再加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差，即為最低檢測限。結(jié)果顯示，試劑盒對飼料樣品的最低檢測限為93.5 μg/kg。

2.4 準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度用添加回收試驗進行檢測。將ZEN添加到陰性飼料樣品中，使其終濃度分別為100.0 μg/kg、200.0 μg/kg、400.0 μg/kg，每個濃度設(shè) 6 個重復(fù)，以添加回收率確定其準(zhǔn)確度。結(jié)果(表2)顯示，試劑盒對添加3個濃度ZEN標(biāo)準(zhǔn)品的飼料樣品回收率為74.5%～109.9%，變異系數(shù)均小于12.9%。

表2 準(zhǔn)確度檢測結(jié)果Table 2 Results of accuracy

2.5 精密度

用ZEN試劑盒檢測濃度為45.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)品10次，共用3批試劑盒檢測，計算批內(nèi)及批間變異系數(shù)。結(jié)果(表3)顯示，用試劑盒檢測濃度為45 μg/L標(biāo)準(zhǔn)品的批內(nèi)變異系數(shù)均小于5.0%，批間變 異系數(shù)為4.2%。

表3 精密度檢測結(jié)果Table 3 Results of precision

2.6 穩(wěn)定性

將試劑盒于4℃和37℃條件下保存，在不同時間制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并檢測陰性樣品和陽性樣品，依據(jù)濃度為0標(biāo)準(zhǔn)品OD值、曲線線性相關(guān)系數(shù)、IC50值、曲線抑制率、樣品回收率判斷試劑盒穩(wěn)定性。結(jié)果(表4)顯示，試劑盒放置于4℃、保存12個月時進行檢測，各項指標(biāo)均正常，保存至14個月時，濃度為0標(biāo)準(zhǔn)品的OD值、標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)及樣品回收率均已不符合產(chǎn)品質(zhì)量要求。試劑盒置于37℃進行加速試驗，保存至8 d時進行檢測，各項指標(biāo)均正常，保存至10 d時，濃度為0標(biāo)準(zhǔn)品的OD值、標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均已不符合產(chǎn)品質(zhì)量要求，綜合以上2個保存試驗結(jié)果得知，試劑盒保存期為12個月。

表4 穩(wěn)定性檢測結(jié)果Table 4 Results of stability

3 討論

酶聯(lián)免疫分析法是將抗原抗體特異性結(jié)合與酶對底物的高效催化結(jié)合起來的一種檢測技術(shù)，已在小分子檢測領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用，是目前公認(rèn)的最適合作為藥物殘留檢測的方法之一［15-16］。用于小分子物質(zhì)檢測的一般為競爭法，根據(jù)原理的不同又可分為直接競爭法和間接競爭法［17］。

本研究在抗玉米赤霉烯酮(ZEN)單克隆抗體基礎(chǔ)上，研制出ELISA定量檢測試劑盒。根據(jù)試劑盒方法所繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為:Y= －2.102 6x+2.744 0，相關(guān)系數(shù)r=0.990 0，IC50濃度為25.1 μg/L，試劑盒的線性檢測范圍為5.0～405.0 μg/L，最低檢測限為 93.5 μg/kg;交叉反應(yīng)試驗表明，抗ZEN抗體對玉米赤霉酮、α-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉醇交叉反應(yīng)率均較高(≥73%)，因此本試劑盒可以檢測玉米赤霉烯酮、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉醇總殘留量。試劑盒對添加3個濃度ZEN標(biāo)準(zhǔn)品的飼料樣品的回收率為74.5% ～109.9%，均符合技術(shù)要求;從精密度結(jié)果可以看出，對標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)檢測，批內(nèi)變異系數(shù)小于4.9%，批間變異系數(shù)為4.2%，而試劑盒對添加3個濃度ZEN標(biāo)準(zhǔn)品的飼料樣品的檢測結(jié)果的變異系數(shù)均小于12.9%，均符合質(zhì)量要求，造成標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的變異系數(shù)差別較大的原因主要是因為飼料中雜質(zhì)較多，經(jīng)前處理后得到的樣品溶液中成分復(fù)雜，影響試驗的均一性;試劑盒在4℃下可放置12個月，同時進行加速試驗得知，試劑盒在37℃下可放置8 d，表明測試盒可在4℃環(huán)境下保存12個月，具有較高的穩(wěn)定性。

以上結(jié)果表明本試劑盒技術(shù)參數(shù)均達(dá)到一般技術(shù)要求，且具有快速、靈敏、特異性好并可同時檢測大量樣品等優(yōu)點，本方法可以作為大批樣品的快速篩選方法，值得推廣應(yīng)用。

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