轉MYB基因小麥耐旱性的初步分析

周淼平， 周小青， 姚金保， 張增艷， 張 鵬， 楊學明， 馬鴻翔

(1.江蘇省農業(yè)科學院生物技術研究所，省農業(yè)生物學重點實驗室，江蘇 南京 210014;2.中國農業(yè)科學院作物科學研究所，北京100081)

MYB蛋白是植物中數量最多且功能最多樣化的轉錄因子家族，主要參與調控植物細胞周期、器官形態(tài)建成、次生代謝以及對逆境脅迫反應的應答，根據MYB結構域重復數的不同可將其劃分為MYB1R、R2R3-MYB、R1R2R3MYB以及4RMYB 等4類［1］。目前MYB基因及其功能在擬南芥、水稻和棉花等作物中已進行了廣泛研究［1-2］。小麥中MYB基因功能的研究相對滯后，目前發(fā)現的MYB基因多參與干旱和鹽害等非生物逆境脅迫反應。Chen等［3］克隆了23個MYB基因片段，但僅有6個得到完整開放閱讀框，用30%PEG處理后，6個MYB基因表達特性各不相同。Cai等［4］通過小麥EST序列電子克隆了36個R2R3-MYB型MYB基因。王轉等［5］從小麥水分脅迫誘導表達的cDNA文庫中檢測到2個MYB基因。利用TaMyb2基因特異引物，賈東升等［6］克隆了3種類型TaMyb2的cDNA序列，轉化擬南芥的結果表明，TaMYB2A基因可以抵御干旱、鹽以及冷害的脅迫［7］。Rahaie等［8］分析了 10 個MYB基因對鹽和干旱脅迫的應答，發(fā)現4個MYB基因在短期鹽脅迫后小麥根部表達上調，3個MYB基因在長期鹽脅迫后基因表達上調，其中TaMYBsdu1基因受長期干旱脅迫后在小麥的根和葉中顯著上調，可能是小麥對鹽和干旱脅迫應答的主要調節(jié)因子。Zhang等［9］克隆了60個小麥MYB基因并進行表達分析，發(fā)現過表達TaMYB32基因可提高轉基因擬南芥的耐鹽性。同樣TaMYB73在轉基因擬南芥中過表達也增加了對鹽脅迫的抵御［10］。這些研究表明，MYB在植物的抗旱耐鹽中具有重要作用。

中國農業(yè)科學院作物科學研究所根據擬南芥AtMYB108基因同源小麥EST序列克隆了小麥TaPIMP1基因，該基因具有典型的MYB基因特點。我們將該基因導入小麥揚麥158，發(fā)現轉基因株系的紋枯病抗性有所提高［11］。由于AtMYB108基因不僅參與擬南芥抗病性的調節(jié)，同時也參與擬南芥的抗逆反應，所以轉基因株系的抗旱耐鹽性有沒有提高值得關注。本研究擬采用轉基因純合株系，通過模擬干旱處理，對部分耐旱性狀指標進行初步分析，以探討該基因在小麥耐旱轉基因種質培育方面的應用潛力。

1 材料與方法

1.1 轉基因材料

純合轉TaPIMP1基因小麥株系B64和B208以及轉基因受體對照揚麥158由本研究室保存。

1.2 模擬干旱對小麥TaPIMP1基因表達的影響

將揚麥158、B64和B208的1葉1心幼苗置于含20%(質量體積比)PEG6000的Hogland營養(yǎng)液中模擬干旱脅迫處理，分別于 0 h、2 h、4 h、8 h、24 h各取5株葉片樣品，等量混合，液氮中磨碎，采用AxyPre RNA提取試劑盒(Promega公司)提取RNA，PrimeScript反轉錄試劑盒(TaKaRa公司)合成cDNA。qRT-PCR采用SYBR@GreenI(TaKaRa公司)在LightCycler2.0熒光定量PCR儀(Roche公司)上進行，內參照基因采用actin基因，基因的相對表達量采用2-△△Ct法計算。TaPIMP1基因擴增引物為5'-ACGGACAACGAGGTCAAGAAC-3'和5'-GAAATGGGCTCCGTGCG-3';actin基因擴增引物為5'-CACTGGAATGGTCAAGGCTG-3'和5'-CTCCATGTCATCCCAGTTG-3'。

1.3 模擬干旱對種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

選取籽粒飽滿、大小一致的揚麥158、B64和B208種子，分別于無菌水和無菌水配置的20%(質量體積比)PEG6000溶液中浸泡12 h后，轉移至墊有濾紙的9 cm培養(yǎng)皿中，每皿50粒左右，置于25℃培養(yǎng)箱中黑暗萌發(fā)，3 d后計算發(fā)芽率。

選取在無菌水中萌發(fā)露白的揚麥158、B64和B208種子置于墊有濾紙的9 cm培養(yǎng)皿中，分別添加無菌水和20%(質量體積比)PEG6000溶液20 ml，于25℃、70%濕度的植物生長箱中培養(yǎng)7 d后，測量胚芽鞘長度、胚根長度，同時調查胚根數。

1.4 模擬干旱對相關生化指標的影響

取形態(tài)長勢一致的5葉期對照植株和轉基因株系植株，洗凈根部后置于1/2MS營養(yǎng)液中培養(yǎng)2 d，再移入含0、5%、10%、15%和20%(質量體積比)PEG6000的營養(yǎng)液中進行不同強度模擬干旱處理，12 h后測定葉片相對含水量、可溶性糖含量、丙二醛(MDA)含量以及過氧化物酶(POD)活性。

1.4.1 小麥葉片相對含水量的測定 參照Siddigue等［12］方法進行，計算公式為:相對含水量=(鮮質量－干質量)/(飽和質量－干質量)×100%。

葉片鮮質量在取樣后2 h內測定，將葉片于20℃蒸餾水中浸泡18 h后測定飽和質量，70℃烘箱中烘烤72 h后測定干質量。

1.4.2 葉片可溶性糖 按張志安等的方法［13］進行，取0.3 g葉片，置于10 ml蒸餾水中，沸水浴30 min，提取液過濾，并定容至25 ml。吸取0.5 ml提取液于試管中，依次加入蒸餾水1.5 ml、9%苯酚1.0 ml和濃硫酸5.0 ml，搖勻，室溫下放置30 min顯色，485 nm波長下測定光密度，計算可溶性糖含量。

1.4.3 葉片MDA含量 采用張志安等方法［13］，取1 g葉片，采用石英砂于2 ml 5%TCA中研磨至勻漿，加入8 ml 5%TCA進一步研磨，勻漿以4 000 r/min離心10 min，吸取上清 2 ml，加入 2 ml 0.6%TBA溶液，混勻，沸水浴10 min，3 000 r/min離心15 min，上清測定532 nm、600 nm、450 nm 處的吸光度值。提取樣品中 MDA濃度，由 C(μmol/L)=6.45(A532－A600)－0.56A450公式計算，根據樣品稀釋倍數換算成葉片中MDA含量。

1.4.4 葉片 POD活性 按張志安等方法［13］進行，取1 g葉片于研缽中，加適量磷酸緩沖液研成勻漿，4 000 r/min離心15 min，上清定容至100 ml;于比色杯中加入反應混合液3 ml和上述提取酶液1 ml，測量波長470 nm下的吸光度值，每隔1 min讀數1次。POD活性以1 min內A470變化0.01為1個過氧化物酶活性單位(U)。根據一定反應時間內吸光度的變化、取樣質量和提取液稀釋倍數計算POD活性。

1.5 統(tǒng)計分析

試驗獲得的數據采用SAS軟件進行顯著性分析。

2 結果

2.1 模擬干旱脅迫對小麥TaPIMP1基因表達的影響

PEG6000模擬干旱處理前，對照揚麥158的TaPIMP1基因有一定的本底表達，2個轉基因株系B208和B64的表達水平基本一致，明顯比揚麥158的表達水平高，主要是因為導入的TaPIMP1基因由玉米ubiquitin組成型啟動子驅動，在轉基因植株內維持了一定量的表達(圖1)。20%PEG6000處理時，對照和轉基因株系的TaPIMP1基因均經歷了明顯的先下調再逐漸上調的過程，處理24 h，轉基因株系B64的表達明顯高于B208和對照揚麥158。先前的研究表明，TaPIMP1基因表達與小麥水分虧缺相關，干旱處理后，小麥TaPIMP1基因表達明顯上調［14］。本研究模擬干旱處理采用的是1葉1心期的幼苗，是否由于生長時期的不同而導致TaPIMP1基因的表達方式產生一定的差異，有待進一步探討。但干旱處理引起TaPIMP1基因表達的劇烈波動，表明該基因與小麥的耐旱性有關聯。

圖1 模擬干旱處理后轉基因株系及其對照TaPIMP1基因的表達分析Fig.1 Expressions of TaPIMP1 gene in transgenic lines(B208 and B64)and control(Yangmai 158)after treatment of PEG6000 osmotic stress

2.2 模擬干旱脅迫對種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

20%PEG6000脅迫處理后，對照揚麥158種子的萌發(fā)受到明顯抑制，發(fā)芽率由100%下降到68.5%;脅迫處理對轉基因株系的種子萌發(fā)影響較小，B64株系發(fā)芽率仍為100%，B208株系雖然由100%下降到83.3%，但仍然極顯著高于揚麥158，表明轉基因株系在種子萌發(fā)時期的耐旱能力比受體對照有所提高。

PEG6000脅迫處理對轉基因株系和受體對照幼苗的胚根數影響不明顯，但胚芽鞘和胚根的伸長受到嚴重抑制。2個轉基因株系胚芽鞘和胚根的伸長明顯好于對照揚麥158(表1)，表明轉基因株系幼苗對干旱的耐受能力優(yōu)于揚麥158。

表1 PEG6000脅迫對轉基因株系和受體對照種子萌發(fā)后生長形態(tài)指標的影響Table 1 Effects of PEG6000 osmotic stress on seedling growth of transgenic plant(B64 and B208)and control(Yangmai 158)

2.3 模擬干旱脅迫對葉片相對含水量的影響

采用不同濃度PEG6000模擬干旱脅迫處理12 h，發(fā)現轉基因株系B64和B208與對照揚麥158的表現不盡相同。在0～15%濃度下，對照和轉基因株系之間的表型變化差異不大，B64株系植株生長狀況稍好，但在20%的濃度下，受體對照揚麥158植株的萎蔫程度明顯比轉基因株系嚴重。

取模擬干旱處理后的小麥葉片，測定葉片相對含水量，發(fā)現5%低濃度處理時，轉基因株系與對照差異不明顯，10% ～20%濃度下，對照揚麥158葉片相對含水量明顯低于轉基因株系(表2)。植物組織含水量對植物的生理活動有重要影響，干旱的直接作用就是引起植物組織失水，導致各種代謝活動的生長紊亂，相對含水量是評價干旱脅迫程度的穩(wěn)定參數［15］。轉基因株系葉片相對含水量明顯高于揚麥158，表明轉基因株系的耐旱性好于受體對照。

表2 轉基因小麥株系和受體對照葉片相對含水量比較Table 2 Comparison of relative water content in the leaves of transgenic lines(B64 and B208)and control(Yangmai 158)

2.4 模擬干旱脅迫對葉片可溶性糖含量的影響

干旱脅迫下，植物體內的可溶性糖會大量積累，以緩解外界脅迫對植物造成的傷害［16-20］。由表3可以看出，當PEG6000濃度為5%時，轉基因株系B64和B208與對照揚麥158的可溶性糖含量差異不大;隨著PEG6000濃度的提高，轉基因株系與對照的可溶性糖含量都有增加趨勢;當濃度達到10%時，轉基因株系與對照的可溶性糖含量差異達到顯著水平;當濃度達到20%時，轉基因B64株系和B208株系的可溶性糖含量比未干旱脅迫處理分別增加了1.43倍和1.29倍，對照植株增加1.04倍，轉基因B64株系和B208株系的可溶性糖含量分別是對照揚麥158的1.47倍和1.29倍，顯示轉基因株系對干旱脅迫的緩解能力有所提升。

表3 轉基因小麥株系和受體對照葉片可溶性糖含量比較Table 3 Comparison of soluble sugar in the leaves of transgenic lines(B64 and B208)and control(Yangmai 158)

2.5 模擬干旱脅迫對葉片MDA含量的影響

MDA是膜脂過氧化的最終產物，是膜系統(tǒng)受傷害的重要標志之一，其含量可以表示膜脂過氧化作用的程度。由表4可以看出，不同濃度PEG6000脅迫下，轉基因株系B64和B208和對照揚麥158的葉片MDA含量均呈增加趨勢，表明干旱脅迫對受試株系的膜系統(tǒng)造成了傷害，并且濃度愈高傷害愈重。5%PEG6000處理時，轉基因株系與對照葉片的MDA含量就出現了顯著差異。不同濃度PEG6000處理，轉基因株系的MDA含量都沒有超過對照;20%濃度處理時，受體對照植株揚麥158的MDA含量已經是未脅迫處理的2.8倍，而轉基因株系B64和B608的MDA含量是未脅迫處理的1.8倍，表明轉基因株系的膜脂受損程度比對照小，也從側面說明轉基因植株的耐旱能力優(yōu)于受體對照。

表4 轉基因小麥株系和受體對照葉片丙二醛含量比較Table 4 Comparison of MDA content in the leaves of transgenic lines(B64 and B208)and control(Yangmai 158)

2.6 模擬干旱脅迫對葉片POD活性的影響

正常情況下，植物細胞內自由基的產生與清除處于一種動態(tài)平衡，一旦這種平衡遭到破壞，自由基便產生積累，POD是植物體內擔負清除H2O2的主要酶類之一，它能催化H2O2氧化其他底物后產生H2O。由表5可知，在不同濃度PEG6000脅迫下，轉基因株系B64和B208和對照揚麥158葉片的POD活性呈現先下降再升高的趨勢，不同處理轉基因株系與對照的POD活性差異沒有達到顯著水平。

表5 轉基因小麥株系和受體對照葉片POD活性比較Table 5 Comparison of POD activity in the leaves of transgenic lines(B64 and B208)and control(Yangmai 158)

3 討論

MYB蛋白是植物的重要調控因子，部分MYB基因參與植物的抗旱調節(jié)。例如厚葉旋蒴苣苔中的BcMYB1可通過不依賴ABA的途徑參與調控基因表達，從而對干旱產生應答，該基因同時也能對PEG、高鹽、低溫等脅迫產生一定程度的應答［21］。擬南芥的AtMYB2基因在干旱脅迫下，可作為ABA誘導的轉錄激活子發(fā)揮作用，在其他一些逆境誘導下AtMYB2表達增強的同時，干旱應答基因rd22和AtADH1的表達也得到加強［22］。AtMYB60參與植物的耐旱脅迫過程也被證實［23］。TaPIMP1基因是根據擬南芥AtMYB108小麥同源EST序列克隆而來，研究發(fā)現擬南芥AtMYB108除了可抑制番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)和黑斑病菌(Alternaria brassicicola)等病原真菌的生長，還受高鹽、干旱、氧脅迫及外源ABA誘導［24］。本研究結果表明，TaPIMP1基因也參與了小麥對干旱脅迫的應答，TaPIMP1基因過表達的轉基因株系在模擬干旱條件下，其種子的萌發(fā)、幼苗的生長以及成株期葉片的相對含水量、可溶性糖含量、MDA含量等指標均優(yōu)于受體對照揚麥158，表明TaPIMP1基因的組成型表達提高了轉基因株系的抗旱性。

中國水資源短缺，人均水資源只有世界平均的1/4。農業(yè)用水占中國用水總量的70%，但農業(yè)灌溉水平均利用率低，不及發(fā)達國家的一半。在中國北方，小麥用水已占農業(yè)用水的70%，因此，節(jié)水已成為中國北方小麥生產的重要研究課題［25］。小麥生產中除了采取節(jié)水栽培和管理措施外，耐旱小麥品種的培育和應用非常關鍵。優(yōu)良小麥品種的培育需要特異種質材料的支撐，除了加強從小麥及其近緣的種質材料中篩選優(yōu)異抗旱節(jié)水種質材料外，拓寬與抗旱節(jié)水相關優(yōu)異基因的發(fā)掘范圍也非常重要，轉基因技術是實現這一目標的重要手段之一。高世慶等［26］將大豆GmDREB基因導入魯麥22號中，轉基因小麥能在10%PEG6000模擬干旱培養(yǎng)基上正常發(fā)芽生長;在18%PEG6000溶液處理后，轉基因小麥的發(fā)芽率比對照明顯提高。將大腸桿菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因和海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶基因的融合基因TPSP導入小麥，發(fā)現轉基因小麥的海藻糖含量大幅提高;20%PEG6000溶液處理后，轉基因株系的脯氨酸含量較對照明顯提高，轉基因植株表現出較強的抗旱能力［27-28］。將棉花GhDREB導入魯麥23中也發(fā)現轉基因株系比對照具有更強的抗旱節(jié)水性能［29］。轉TaEBP基因小麥株系的抗旱節(jié)水性能也明顯高于受體對照寧春9號［30］。我們將由玉米ubiquitin組成型啟動子驅動的小麥MYB蛋白基因TaPIMP1導入揚麥158，也發(fā)現轉基因株系的耐旱能力較受體對照有所提高。這些研究表明，轉基因方法可以作為常規(guī)育種方法的補充和延伸，該方法能打破物種間的界限，將其他物種的有利基因引入到小麥中，提高小麥的耐旱性。

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