乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)乳酸鈣的條件優(yōu)化

陳文潔，張京震，郭建峰*

（1.中北大學(xué) 化工與環(huán)境學(xué)院，山西 太原 030051；2.山西省經(jīng)濟(jì)建設(shè)投資有限公司，山西 太原 030012）

乳酸鈣是一種重要的化工原料，主要應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和飼料行業(yè)。在食品工業(yè)中，乳酸鈣作為安全的食品添加劑，可用于固化劑、風(fēng)味增強(qiáng)劑、調(diào)味劑、配料、食品松軟劑、營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)品及穩(wěn)定劑和增稠劑使用；在醫(yī)藥行業(yè)是人和動(dòng)物的主要補(bǔ)鈣劑；在輕工行業(yè)作為抗菌劑和除垢劑用于牙膏中[1-3]。

由于目前乳酸鈣的制備成本偏高，有效地降低乳酸鈣生產(chǎn)成本對(duì)其市場(chǎng)應(yīng)用具有積極的推動(dòng)作用[4-5]。工業(yè)中淀粉廢水的排放量與日俱增，會(huì)污染環(huán)境且造成資源浪費(fèi)[6]。為了充分利用廢水中的淀粉等資源，降低乳酸鈣生產(chǎn)成本，試驗(yàn)通過(guò)葡萄糖作為乳酸菌生長(zhǎng)發(fā)酵的碳源，對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，探索最優(yōu)發(fā)酵工藝條件，提高乳酸鈣產(chǎn)量，為后續(xù)研究利用淀粉廢水發(fā)酵提供理論依據(jù)和試驗(yàn)基礎(chǔ)條件。以其為后期的應(yīng)用探索合適發(fā)酵條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)菌種

保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）：試驗(yàn)室儲(chǔ)藏；脫脂乳粉為市售。

1.1.2 培養(yǎng)基

MRS固體培養(yǎng)基：在MRS培養(yǎng)基中加入1.5%瓊脂。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖，酵母膏，MgSO4·7H2O，磷酸二氫鉀。保藏培養(yǎng)基：在MRS培養(yǎng)基中加入1%的CaCO3。

1.2 儀器與設(shè)備

BS210電子天平：上海精密科學(xué)有限公司；YXQ-SG46-280S手提式高壓蒸汽滅菌鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-2F無(wú)菌操作臺(tái)：寧波科森凈化器制造有限公司；DHP060型恒溫培養(yǎng)箱：上海飛越試驗(yàn)儀器有限公司；PHS-3C精密pH計(jì)：杭州奧利龍有限公司；721可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海第三分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法

乳酸菌的活化：取一環(huán)生長(zhǎng)良好的斜面種子，接入液體活化培養(yǎng)基中，至于36℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)活化2次備用。乳酸菌富集培養(yǎng)：在無(wú)菌條件下，用移液管吸取一定量活化后的菌懸液，加入MRS培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸培養(yǎng)：在250mL錐形瓶中加入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基，在無(wú)菌條件下，用移液管吸取一定量活化后的菌懸液，加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

發(fā)酵法制取乳酸鈣：將活化后的菌懸液接入添加有碳酸鈣的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在試驗(yàn)所得的最優(yōu)條件下進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.2 分析方法

（1）乳酸菌生長(zhǎng)情況測(cè)定

用移液管吸取培養(yǎng)一定時(shí)間后的菌懸液，稀釋5～10倍后，使用721分光光度計(jì)在波長(zhǎng)660nm處測(cè)定其吸光度值。

（2）發(fā)酵產(chǎn)酸量測(cè)定

用0.1mol/L的NaOH對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行滴定，溴甲酚紫為指示劑，溶液由橙黃色變?yōu)樗{(lán)紫色即達(dá)到滴定終點(diǎn)[7]。記錄滴定消耗NaOH的體積數(shù)，mL。

乳酸產(chǎn)量按下式計(jì)算：

式中：X 為乳酸產(chǎn)量，g/L；VNaOH為滴定消耗的氫氧化鈉體積數(shù)，mL；90.08 為乳酸的摩爾質(zhì)量，g/mol；V為樣品的體積，mL。

（3）乳酸鈣總量的測(cè)定

本試驗(yàn)通過(guò)乙二胺四乙酸二鈉中和滴定法測(cè)定所產(chǎn)乳酸鈣的總量[8]。

1.3.3 乳酸鈣的提取方法

將在最佳條件下獲得的發(fā)酵液過(guò)濾，以除去菌體及未反應(yīng)的碳酸鈣，在濾液中加入氧化鈣調(diào)pH值至12～13，并加入0.4%的MgSO4沉聚菌體蛋白[9-11]，在80℃，攪拌反應(yīng)30min后，趁熱抽濾得乳酸鈣母液，再將母液進(jìn)行加熱濃縮，當(dāng)母液中乳酸鈣質(zhì)量濃度達(dá)到145g/L～15g/L[12-13]時(shí)，冷卻靜置結(jié)晶24h。分離晶體和母液，由于乳酸鈣在水中的溶解度較大，結(jié)晶母液中還留有大量的乳酸鈣，濃縮后再次結(jié)晶，合并晶體[14]。

1.3.4 乳酸菌生長(zhǎng)條件單因素試驗(yàn)

（1）乳酸菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

制備7瓶50mL相同條件的MRS培養(yǎng)基，按2%的接種量接種，30℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，在2h、5h、8h、12h、15h、20h、24h 后分別取出一瓶測(cè)其OD值，以確定菌種生長(zhǎng)情況。

（2）不同pH值對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)情況影響

在6個(gè)裝有50mL MRS培養(yǎng)基的錐形瓶中，添加氫氧化鈉或乙酸調(diào)整培養(yǎng)基的起始pH值，分別為3.2、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，按2%的接種量接種，在30℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，12h后測(cè)其生長(zhǎng)情況。

（3）不同的培養(yǎng)溫度對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)情況的影響

將裝有50mL MRS培養(yǎng)基的錐形瓶滅菌后，按2%的接種量接種，分別放置于28℃、30℃、32℃、36℃、38℃、40℃、42℃條件下培養(yǎng)12h后，測(cè)量生長(zhǎng)情況。

（4）不同的接種量對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)情況的影響

在裝有50mL MRS培養(yǎng)基的錐形瓶中，用滅菌后的移液管分別接入2%、5%、8%、10%、12%、15%的乳酸菌菌懸液，在之前試驗(yàn)確定的最佳溫度條件下培養(yǎng)12h后測(cè)其生長(zhǎng)情況。

（5）不同的裝液量對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)情況的影響

分別往6個(gè)250mL的錐形瓶中加入25mL、50mL、75mL、100mL、150mL、200mL的MRS培養(yǎng)基，并接入2%的乳酸菌菌懸液[15]，置于之前試驗(yàn)確定的最佳溫度下培養(yǎng)12h后，分別測(cè)其生長(zhǎng)情況。

1.3.5 發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

將酵母膏、MgSO4·7H2O、磷酸二氫鉀的用量固定，以酸度為考察指標(biāo)，優(yōu)化溫度（A）、時(shí)間（B）、接種量（C）、葡萄糖含量（D）和初始pH值（E）為5個(gè)因素，設(shè)計(jì)L16（45）正交試驗(yàn)分析發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果，因素水平見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化L16(45)正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of the L16(45) orthogonal experiment for fermentation medium optimization

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

圖1 菌種生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of lactic acid bacteria

菌液的OD值在一定程度上反映了菌體的生長(zhǎng)情況，由圖1可知，菌體經(jīng)過(guò)較短的延遲期后即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，到12h時(shí)達(dá)到較高水平，此后雖然OD值一直增大但變化幅度趨于平穩(wěn)，表明菌株此時(shí)進(jìn)入穩(wěn)定期。

2.2 乳酸菌生長(zhǎng)條件單因素試驗(yàn)

2.2.1 初始pH值的影響

pH值是影響微生物生長(zhǎng)代謝的一個(gè)重要因素，乳酸菌在生長(zhǎng)過(guò)程中，對(duì)pH值有著嚴(yán)格的要求。37℃培養(yǎng)12h后，測(cè)其OD值，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 pH值對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effect of pH value on the growth of lactic acid bacteria

由圖2可知，在一定的pH值范圍內(nèi)，初始pH值越高，菌種生長(zhǎng)越好，在pH值為6.0時(shí)，菌種達(dá)到最佳生長(zhǎng)條件，隨后pH值的增大會(huì)抑制菌種生長(zhǎng)。因此，之后發(fā)酵優(yōu)化中初始pH值選取在5.5～7.0的范圍內(nèi)。由于pH值在自然情況下，生長(zhǎng)情況尚好，為方便起見(jiàn)，后期試驗(yàn)采用自然條件的pH值。

2.2.2 裝液量的影響

裝液量將直接影響培養(yǎng)基里的供氧量，過(guò)多將影響菌體的呼吸作用，菌體的生長(zhǎng)將受到抑制，過(guò)少將浪費(fèi)培養(yǎng)基里的氧氣。本試驗(yàn)選取了10%～80%的裝液量做單因素試驗(yàn)，37℃培養(yǎng)12h后，測(cè)其OD值，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 裝液量對(duì)菌種生長(zhǎng)的影響Fig.3 Effect of liquid volume on the growth of lactic acid bacteria

從圖3可知，乳酸菌雖為兼性厭氧菌，但是裝液量越少時(shí)，生長(zhǎng)越好，由于10%的裝液量過(guò)少，且20%的裝液量效果尚佳，所以之后發(fā)酵選擇20%的裝液量。

2.2.3 接種量的影響

將活化后的乳酸菌種子培養(yǎng)基分別以2%、5%、8%、10%、12%、15%接種量接種于MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12h后，測(cè)其OD值，結(jié)果見(jiàn)圖4。

從圖4可知，接種量為8%時(shí)，菌種生長(zhǎng)最佳，在低于8%時(shí)，接種量越高，生長(zhǎng)越好，當(dāng)接種量高于8%時(shí)，生長(zhǎng)量反而減少。由于2%～10%接種量的結(jié)果（OD值）差距不大，所以在活化菌種時(shí)為節(jié)約菌種采用2%的接種量，之后發(fā)酵水平選取在2%～10%的區(qū)間內(nèi)。

圖4 接種量對(duì)菌種生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effect of inoculum on the growth of lactic acid bacteria

2.2.4 溫度對(duì)菌種生長(zhǎng)的影響

乳酸菌的生長(zhǎng)隨溫度變化，試驗(yàn)分別在28℃、30℃、32℃、36℃、38℃、40℃培養(yǎng)12h。OD值變化見(jiàn)圖5。

圖5 溫度對(duì)菌種生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effect of temperature on the growth of lactic acid bacteria

從圖5可知，乳酸菌生長(zhǎng)OD值在32℃～38℃較高，在35℃～37℃達(dá)到最高水平。在此水平前，菌種隨溫度的升高而呈現(xiàn)良好的生長(zhǎng)趨勢(shì)，高于此水平溫度時(shí)，菌種受高溫的抑制，雖然可以生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)變得緩慢。

2.3 菌種發(fā)酵條件的優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以滴定酸度為考察指標(biāo)采，用L16（45）進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，最優(yōu)組合為A4B4C3D4E4，即培養(yǎng)溫度40℃，培養(yǎng)時(shí)間96h，接種量8%，葡萄糖含量10%，初始pH值為7.0。由極差大小可知，因素對(duì)菌種發(fā)酵產(chǎn)酸影響主次順序?yàn)闀r(shí)間＞溫度＞接種量＞葡萄糖含量＞初始pH值。

按照優(yōu)選出的發(fā)酵培養(yǎng)基條件A4B4C3D4E4制備發(fā)酵培養(yǎng)基，葡萄糖含量為10%，初始pH值為7.0，接種量為8%，于40℃培養(yǎng)96h，其最終酸度為75°T。

2.4 乳酸鈣的測(cè)定和提取

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的L16(45)正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Result and analysis of the L16(45) orthogonal experiment for fermentation medium optimization

在最優(yōu)發(fā)酵條件的培養(yǎng)基中加入碳酸鈣，其用量為乳酸產(chǎn)量的120%，即0.52g，按照最優(yōu)條件進(jìn)行發(fā)酵，反應(yīng)結(jié)束后，用乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）滴定發(fā)酵液，測(cè)得乳酸鈣含量為27.28g/L。

將4瓶50mL發(fā)酵液統(tǒng)一處理，通過(guò)純化除雜，濃縮結(jié)晶得乳酸鈣成品3.93g，計(jì)算得乳酸鈣提取率為72.0%。

3 結(jié)論

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，乳酸菌種子培養(yǎng)基的最佳條件為接種量8%，裝液量20%，溫度36℃，初始pH值為6.0，接種后12h菌種活性較高，適合下一代的接種。對(duì)乳酸桿菌進(jìn)行乳酸發(fā)酵優(yōu)化后，確定了最佳發(fā)酵條件：時(shí)間96h，溫度40℃，葡萄糖含量10%，接種量8%，初始pH值為7.0。各因素對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸的影響順序?yàn)闀r(shí)間＞溫度＞接種量＞碳源＞初始pH值。在最優(yōu)條件下進(jìn)行發(fā)酵，可得乳酸產(chǎn)量為8.64g/L，發(fā)酵液中乳酸鈣含量可達(dá)27.28g/L。通過(guò)過(guò)濾除去菌體和未反應(yīng)的碳酸鈣，等電點(diǎn)沉淀法除去蛋白質(zhì)，濃縮結(jié)晶提取乳酸鈣。最終乳酸鈣的提取收率為72%。該研究?jī)H對(duì)菌種生長(zhǎng)條件和發(fā)酵培養(yǎng)基條件進(jìn)行了研究，葡萄糖轉(zhuǎn)換率較低，今后可以對(duì)該菌進(jìn)行誘變[16-17]以提高菌種性能和乳酸產(chǎn)量。

[1]TAY A,YANG S T.Production of L-lactic acid from glucose and starch by immobilized cells ofRhizopus oryzaein a rotating fibrous bed bioreactor[J].Biotechnol Bioeng,2002,80(10):1-12.

[2]賴譜富.利用花蛤殼制備乳酸鈣的新工藝研究[D].福建：福建農(nóng)林大學(xué)碩士論文，2009.

[3]陳黎洪，楊 穎，任發(fā)政，等.乳酸菌發(fā)酵法生產(chǎn)高鈣雞骨泥的工藝研究[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2011，11（2）：104-108.

[4]徐 忠，汪群慧，姜兆華.L-乳酸的制備及其應(yīng)用的研究進(jìn)展[J].化學(xué)與粘合，2004，214（4）：214-217.

[5]ALTAF M D,NAVEENA B J,VENKATESHWAR M,et al.Single step fermentation of starch to L (+) lactic acid byLactobacillus amylophilusGV6 in SSF using inexpensive nitrogen sources to replace peptone and yeast extract-optimization by RSM[J].Process Biochem,2006,41(2):465-472.

[6]苑廣志.一株乳酸菌發(fā)酵條件優(yōu)化及檢測(cè)方法的建立[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2012，33（11）：197-201.

[7]LEE C W.Production of D-lactic acid by bacterial fermentation of rice[J].Fibers Polym,2007,8(6):571-578.

[8]GB/T 5009.92-2003 食品中鈣的測(cè)定[S].

[9]梅笑冰.食品添加劑乳酸鈣制備工藝研究[D].西安：西北大學(xué)碩士論文，2009.

[10]王振鐸.L-乳酸鈣的生產(chǎn)工藝[J].山西食品工業(yè)，2000（1）：26-27.

[11]李逢振，馬美湖，李彥坡，等.雞蛋殼直接中和制取乳酸鈣的工藝[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2010，26（2）：370-374.

[12]王 玉，吳 疆，吳家鑫.一株耐高溫乳酸菌的發(fā)酵條件優(yōu)化[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2012，33（5）：161-164.

[13]孫天松，劉紅霞，倪慧娟，等.傳統(tǒng)發(fā)酵酸駝乳中乳酸菌的分離及鑒定[J].中國(guó)乳品工業(yè)，2006，39（6）：4-7.

[14]田國(guó)軍，尚艷艷，黃澤元.臘魚(yú)中優(yōu)勢(shì)乳酸菌的分離、純化及性質(zhì)鑒定[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37（6）：78-81.

[15]JOHNR P,ANISHA G S,NAMPOOTHIRI K M,et al.Direct lactic acid fermentation:focus on simultaneous saccharification and lactic acid production[J].Biotechnol Adv,2009,27(2):145-152.

[16]凌代文，東秀珠.乳酸細(xì)菌分類鑒定及實(shí)驗(yàn)方法[M].北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1999.

[17]魯明波，曾 翔，張 力，等.紫外線誘變和恒化器培養(yǎng)篩選耐高溫的高產(chǎn)乳酸菌[J].微生物學(xué)通報(bào)，2010，37（4）：520-523.