鋅離子影響地中海擬無枝酸菌合成有機酸和利福霉素SV

鄧鵬飛，周 峰，李長軍，陳 雄，黃亞男，王 志*

（1.湖北工業(yè)大學，湖北 武漢 430068；2.河南省南街村（集團）有限公司，河南 臨潁 462600）

利福霉素SV是由一個萘醌發(fā)色團和脂肪鏈橋組成的[1]。萘醌發(fā)色團的主要成分是3-氨基-5-羥基苯甲酸（即AHBA），由合成芳香族氨基酸的莽草酸途徑的平行途徑合成[2]；AHBA為利福霉素芳香發(fā)色基團的直接前體[3-4]，因而，芳香氨基酸可協(xié)同抑制AHBA的生物合成[5]。脂肪鏈橋部分由8個甲基丙二酰-CoA單位和2個丙二酰-CoA單位在I型聚酮合成酶（PKS）的作用下連續(xù)縮合延伸而成[6]。焦瑞身等[7]報道：利福霉素的氨同化途徑主要包含丙氨酸脫氫酶（ADH）、谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸合成酶（GOG TA），ADH在A.mediterraneiU32中的活力與利福霉素的生物合成具有負相關性，而且（GS）/（ADH）酶活性比值增大與利福霉素SV產(chǎn)量有正相關性。GS和ADH受到氨濃度的調節(jié)，高濃度氨有利于ADH催化活性增強，而低濃度氨時GS催化活性增強。這種相關性表明，GS不僅是同化氨的重要酶，而且在利福霉素生物合成過程中起著關鍵作用[8]。

基于此分析，若能提高GS的活性或者抑制ADH的積累，從而提高（GS）/（ADH）比值，可能會使代謝朝著有利于利福霉素SV合成的方向進行。工業(yè)發(fā)酵微生物在生長繁殖和產(chǎn)物合成中都需要微量金屬元素作為酶的組成部分或作為酶的活性調節(jié)劑[9]。有文獻報道，丙氨酸脫氫酶可被鋅離子所抑制[10]。因此，本研究討論了Zn2+對地中海擬無枝酸菌生物合成有機酸和利福霉素SV的影響，根據(jù)發(fā)酵過程中有機酸和氨基酸的變化，探討了Zn2+影響利福霉素SV合成的機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種來源

地中海擬無枝酸菌（Amycolatopsis mediterranei）U-32由河南省南街村（集團）有限公司技術中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖1.5%，黃豆餅粉1%，蛋白胨2%，CaCO30.2%，KNO30.05%。115℃、20min條件下蒸汽滅菌，備用。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖6.0%，磷酸二氫鉀0.02%，黃豆餅粉1.5%，碳酸鈣0.5%，蛋白胨2%，KNO30.8%。120℃、20min條件下蒸汽滅菌，備用。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：

一級種子：從試管斜面上挖塊0.5cm×2cm大小菌落接種于三角瓶（50mL/250mL）種子培養(yǎng)基中，在搖床上培養(yǎng)48h，培養(yǎng)條件為28℃、220r/min。

二級種子：將培養(yǎng)好的一級種子取3mL接種于三角瓶50mL/250mL）種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為28℃、220r/min，在搖床上培養(yǎng)48h后合瓶備用。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)：將以上培養(yǎng)好的二級種子液都以3mL接種于三角瓶（50mL/250mL）發(fā)酵培養(yǎng)基，在搖床上培養(yǎng)141h后放瓶，培養(yǎng)條件為28℃、220r/min。

10L發(fā)酵罐培養(yǎng)：計料體積6L，二級種子接種量6%。培養(yǎng)條件為28℃、220r/min，空氣流量為0.5m3/h，培養(yǎng)141h后放罐。

1.2.2 效價測定方法

按照參考文獻[11]進行。

1.2.3 氨基酸的檢測

衍生化氣相色譜法，以乙酸苯乙酯為內標，操作參考文獻進行[12-13]。

2 結果與分析

2.1 搖瓶培養(yǎng)添加鋅離子對利福霉素SV效價的影響

由圖1可知，鋅離子在低濃度時，隨著濃度的增加，利福霉素SV的產(chǎn)量不斷提高，0.75mg/L時達到最大，此時的效價比對照增加了4.3%；而當鋅離子加量超過0.75mg/L時，利福霉素SV的產(chǎn)量增加甚微，可能是高濃度的鋅離子對菌體產(chǎn)生了毒性。

2.2 10L罐培養(yǎng)添加0.75mg/L鋅離子對利福霉素SV合成和pH值的影響

圖1 鋅離子濃度對利福霉素SV效價的影響Fig.1 Effect of Zn2+addition on rifamycin SV in shake flasks

10L罐培養(yǎng)中基料添加0.75mg/L鋅離子對利福霉素SV合成和pH值的影響見圖2。發(fā)酵過程中的pH值趨勢與對照相似，總體上添加組pH值比對照低0.40%～1.60%，說明其氨基酸和有機酸代謝可能存在差異。另外，72h前利福霉素SV效價的增長與對照相似，96h時利福霉素SV的產(chǎn)量提高了11.72%，120h時效價提高了9.1%，但141h時僅提高了3.5%。

圖2 10L罐培養(yǎng)添加0.75mg/L鋅離子對利福霉素SV合成和pH值的影響Fig.2 Effect of Zn2+addition(0.75mg/L)on rifamycin SV production and pH value in a 10L bioreactor

2.3 10L罐發(fā)酵培養(yǎng)添加0.75mg/L鋅離子對氨基酸和丙酮酸合成的影響

發(fā)酵過程中胞外丙酮酸和氨基酸的變化規(guī)律見圖3～圖5。發(fā)酵過程中（72h～141h），胞外丙酮酸濃度為49.98mg/L～85.63mg/L，比對照提高19.73%～93.72%，尤其是72h時，丙酮酸濃度為49.98mg/L，是對照組的1.94倍；胞外丙氨酸濃度在3.97mg/L～18.33mg/L之間，只有對照的40.45%～62.31%，特別是在96h胞外丙氨酸的濃度為11.90mg/L，比對照降低60%。這說明鋅離子確實抑制了丙氨酸脫氫酶的活性，致使丙氨酸（Ala）積累明顯減少，同時引起該酶催化底物——丙酮酸的積累。由于Ala會對谷氨酰胺合成酶產(chǎn)生抑制作用[9]，所以Ala降低會引起谷氨酰胺合成酶活力的提高，從而促進谷氨酰胺（Gln）的積累，而Gln會直接促進利福霉素SV的合成，使得利福霉素SV效價提高。

圖3 10L罐培養(yǎng)添加0.75mg/L鋅離子對胞外丙氨酸和丙酮酸合成的影響Fig.3 Effect of Zn2+addition(0.75mg/L)on Ala and pyruvatein a 10L bioreactor

圖4 10L罐培養(yǎng)添加0.75mg/L鋅離子對谷氨酸和賴氨酸合成的影響Fig.4 Effect Zn2+addition(0.75mg/L)on Glu and Lys in a 10L bioreactor

圖5 10L罐培養(yǎng)添加0.75mg/L鋅離子對苯丙氨酸和酪氨酸合成的影響Fig.5 Effect of Zn2+addition(0.75mg/L)on Pheand Tyr in a 10L bioreactor

由圖4可知，96h～141h胞外谷氨酸濃度為12.59mg/L～948.12mg/L時，比對照提高7.62%～162.59%，尤其是在96h達到了927.30mg/L，是對照的2.63倍；賴氨酸濃度為20.97mg/L～26.23mg/L時，比對照提高1.99%～43.10%，尤其是在96h時，賴氨酸濃度為24.16mg/L，是對照組的1.22倍。這證實了之前的分析：鋅離子抑制了丙氨酸脫氫酶活性，Ala合成效率下降，從而使丙酮酸向Ala的轉化量減少而積累，這會引起三羧酸循環(huán)的碳流增大。由于谷氨酸（Glu）和賴氨酸（Lys）為三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物-酮戊二酸和草酰乙酸衍生，因此，三羧酸上游碳通量增大促進了其合成效率。

72h～141h胞外苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr）濃度趨勢見圖5。胞外酪氨酸濃度（72h～120h）與對照差異不大，但是，141h時酪氨酸濃度是1.65mg/L，是對照組的2.56倍；胞外苯丙氨酸濃度為1.64mg/L～11.13mg/L，比對照提高25.84%～92.89%。120h時Phe濃度5.48mg/L，是對照組的1.93倍。表明鋅離子除了使丙氨酸脫氫酶的活性下降引起Ala濃度減少、丙酮酸積累和促進三羧酸循環(huán)碳代謝以外，丙酮酸的積累還通過反饋抑制作用在發(fā)酵中后期促進了葡萄糖-6-磷酸流入磷酸戊糖途徑，從而使由磷酸烯醇式丙酮酸和4-磷酸-赤蘚糖衍生的芳環(huán)氨基酸（如Phe）濃度在發(fā)酵中后期濃度高于對照組。但是3-脫氧-阿拉伯庚酮糖酸-磷酸（DAHP）合成酶是莽草酸途徑的第一個酶，其受到芳香族氨基酸的協(xié)同反饋抑制作用[4]。而利福霉素SV的芳環(huán)發(fā)色前體（AHBA）是由于莽草酸途徑平行的代謝途徑合成的[14]，并受到芳環(huán)氨基酸的協(xié)同抑制作用[4-5]。圖5證實了Phe在發(fā)酵中后期明顯積累，這可能就是發(fā)酵后期利福霉素SV效價增加乏力的原因。

3 結論

錢世鈞等[15]曾報道丙氨酸雖不是谷氨酰胺代謝的直接產(chǎn)物，但其對GS表現(xiàn)了強烈的抑制作用。同樣的結果在許多來源的GS中都能發(fā)現(xiàn)[5]。本文研究發(fā)現(xiàn)鋅離子抑制了丙氨酸脫氫酶活性，Ala合成效率下降，引起丙酮酸向Ala的轉化量減少，使其得到了積累。同時引起三羧酸循環(huán)的碳流增大，并引起由-酮戊二酸衍生的Glu合成量增大。倪榴英等[15]曾研究GS的活力與利福霉素SV的產(chǎn)量間有正的相關性，而谷氨酰胺是Glu由谷氨酰胺合成酶（GS）催化生成，谷氨酰胺的酰胺氮又是3-氨基-5-羥基苯甲酸（AHBA）直接供體[16-17]，這樣就促進了利福霉素SV的合成。但是丙酮酸的積累同樣在發(fā)酵后期促進了磷酸戊糖途徑碳流量增大，從而使芳環(huán)氨基酸（如Tyr、Phe）濃度在發(fā)酵中后期濃度高于對照組。但是利福霉素SV的芳環(huán)前體AHBA是由于莽草酸途徑平行的代謝途徑合成的[14]，因此，AHBA的合成勢必會受到芳環(huán)氨基酸的協(xié)同抑制作用。Phe在發(fā)酵中后期明顯積累，這可能就是發(fā)酵后期利福霉素SV效價增加乏力的原因，這為下一步的研究確定了方向。

[1]BUJNOWSKI K,SYNORADZKI L,DNJUS E,et al.Rifamycin antibiotics new compounds and synthetic methods.Part 1:Study of the reaction of 3-formyl rifamycin SV with primary alkylamines or ammonia[J].Tetrahedron，2003，59：1885-1893.

[2]GHISALBA O,NUESCH J.A genetic approaeh to the biosynthesis of the rifamycin chromophoreinNocardia mediterranei.Ⅰisolation and charaetcrization of a pentose excreting auxotrophic mutant ofNocardia mediterraneiwith drastically reduced rifamycin production[J].J Antibiot,1978，31（3）：202-214.

[3]HATANO K,AKIYAMA S,ASAI M,et al.Biosynthetic origin of aminobenzenoid nucleus(C7N-unit)of ansamitocin,a group of novel maytansinoid antibiotics[J].J Antibiot，1982,35（10）:1415-1417.

[4]顧薇玲，夏天輝，焦瑞身.芳香途徑終產(chǎn)物和中間體對力復霉素SV生物合成的調節(jié)作用[J].微生物學報，1988，28（1）：56-61.

[5]STADTMAN ER,HUBBARD JS.Regulation of glutamine synthetase[J].J Bacteriol，1967，93：1045-1055.

[6]CHIAO J S，倪榴英.利福霉素SV生物合成的代謝調節(jié)的研究[J].國外醫(yī)藥杭生素分冊，1990，11（2）：92-96.

[7]倪榴英，焦瑞身.幾種氮化合物對地中海諾卡氏菌U-32氨同化酶的影響[J].抗生素雜志，1984，9（4）：301-306.

[8]OKAMI Y.Biology of Actinomycetes 88[M].Tokyo:Japan Scientific Societits Press,1988.

[9]陳天壽，嚴德喜，李根生等.微生物培養(yǎng)基的制造和應用[M].北京：中國農業(yè)出版社，1995.

[10]張嗣良，儲 炬.多尺度微生物過程優(yōu)化[M].北京：化學工業(yè)出版社，2003.

[11]商純良.利福霉素SV發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化和代謝初步分析[D].武漢：湖北工業(yè)大學碩士論文，2011.

[12]張 健.赤霞珠無醇干紅葡萄酒的香氣成分分析[J].中國釀造，2007，26（8）：65-67.

[13]杜 曦，周錫蘭，余 錄，等.葡萄及葡萄酒中有機酸測定的衍生化氣相色譜法[J].釀酒，2008，35（3）：82-84.

[14]JS CHIAO，倪榴英.利福霉素SV生物合成的代謝調節(jié)的研究[J].國外醫(yī)藥抗生素分冊，1990，11（2）：92-96.

[15]錢世鈞，孟廣震，郝鳳兮，等.北京棒狀桿菌AS1.299谷氨酰胺合成酶活力調節(jié)的研究[J].生物化學雜志，1986，2（2）：85-88.

[16]倪榴英，劉慈俊，金志坤，等.力復霉素與谷氨酰胺合成酶活力的正相關性[J].微生物學報，1984，24（3）：217-223.

[17]焦瑞身，劉慈俊，金志坤，等.力復霉素生物合成中氮原子的參入途徑[J].中國科學，1983（12）：1097-1104.