飼用枯草芽孢桿菌分離純化及培養(yǎng)條件優(yōu)化*

胡 賽，孫 成，劉素梅，賈付康，滿 云

(蚌埠學(xué)院，安徽 蚌埠 233030)

枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)迅速，營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單且在生長(zhǎng)發(fā)育后期形成含水率低、抗逆性強(qiáng)的休眠體芽孢，是制備微生物菌制劑的理想形式。枯草芽孢桿菌在添加到飼料時(shí)不僅不消耗飼料的營(yíng)養(yǎng)，還能保持飼料的質(zhì)量，提高飼料利用率；進(jìn)入畜禽腸道可迅速恢復(fù)活性發(fā)揮益生菌作用；能夠產(chǎn)生許多不同活性的酶類和多種氨基酸[1-3]。目前，響應(yīng)面分析法被廣泛應(yīng)用于食品、輕工、醫(yī)藥衛(wèi)生等多方面研究領(lǐng)域。本課題通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)對(duì)飼用枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)條件進(jìn)行，提高枯草芽孢桿菌發(fā)酵液菌密度及活菌數(shù)量[4-7]，為低成本生產(chǎn)飼用枯草芽孢桿菌提供數(shù)據(jù)支撐[8]。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要儀器

AB323電子天平，上海?？惦娮觾x器廠；YX-24HDD手提式壓力蒸汽滅菌器，江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；PWT-P42B電熱恒溫培養(yǎng)箱，合肥華德利科學(xué)器材有限公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺(tái)，上海力辰邦西儀器科技有限公司；SW-CJ-2FO紫外可見分光光度計(jì)，上海博迅；DHZ-DA全溫振蕩培養(yǎng)箱，上海五相儀器儀表有限公司；DHG-9023A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海東麓儀器設(shè)備有限公司。

1.1.2 主要試劑與材料

葡萄糖，天津市永大化學(xué)試劑有限公司；蛋白胨，上海盛思生化科技有限公司；酵母浸膏粉、牛肉浸膏粉，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；瓊脂粉，上海展云化工有限公司。

供試菌種：蚌埠學(xué)院食品與生物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供。

固體培養(yǎng)基[9-10]：每1 L的蒸餾水加入牛肉浸膏0.5 g、蛋白胨15 g、氯化鈉5 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g。

液體培養(yǎng)基：每1 L的蒸餾水加入牛肉浸膏0.5 g、大豆蛋白胨15 g、氯化鈉5 g、葡萄糖20 g。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種分離純化

(1)菌液準(zhǔn)備：稱取0.1 g固體菌粉溶于100 mL無菌水中，備用。

(2)平板劃線：固體培養(yǎng)基，經(jīng)過121 ℃，20 min高壓滅菌鍋高壓滅菌后冷至不燙手后，在無菌操作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行倒平板，將(2)準(zhǔn)備好的菌液，用接種環(huán)蘸取菌液進(jìn)行平板劃線，放入恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃)培養(yǎng)24 h。

1.2.2 制備種子液[11]

取平板劃線獲得的單一菌落接種于高壓滅菌121 ℃、20 min后液體培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床培養(yǎng)，搖床培養(yǎng)條件為35 ℃、180 r/min、24 h。取上述菌液1 mL加入9 mL無菌水，重復(fù)上述步驟獲得三個(gè)不同濃度梯度菌液，本實(shí)驗(yàn)選擇的三個(gè)不同的稀釋倍數(shù)分別為103倍、104倍、105倍。

1.2.3 活菌計(jì)數(shù)

取不同培養(yǎng)條件下?lián)u床培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌菌液，進(jìn)行梯度稀釋，分別取106、107、108三個(gè)不同梯度稀釋進(jìn)行平板涂布，將涂布完成的平板用保鮮膜包裹防止染上雜菌，然后放入恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，通過直接讀數(shù)法確定菌落數(shù)。

1.2.4 OD600值的測(cè)定

OD600值測(cè)定采用600 nm波長(zhǎng)下的吸光度。菌液搖床培養(yǎng)24 h，每隔3 h測(cè)一次OD600，根據(jù)培養(yǎng)時(shí)間和OD600值的對(duì)應(yīng)關(guān)系，繪制菌株的生長(zhǎng)曲線，便于后續(xù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。

1.2.5 單因素試驗(yàn)

(1)裝液量對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

通過改變裝液量來探究溶氧量對(duì)枯草芽孢桿菌菌體生長(zhǎng)和芽孢生成的影響。本實(shí)驗(yàn)采用250 mL錐形瓶，研究表明搖瓶不同裝液量對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)有明顯的影響，實(shí)驗(yàn)采用30 mL、50 mL、70 mL、90 mL四種不同裝液量，35 ℃、180 r/min、pH 7、接種量6%進(jìn)行搖床培養(yǎng)18 h，測(cè)定不同裝液量對(duì)搖床培養(yǎng)活菌數(shù)和OD值的影響，篩選出最佳裝液量。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。

(2)起始pH值對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響[12]

根據(jù)OD600值確定枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)最佳起始pH值采用pH 5、pH 6、pH 7、pH 8四種不同起始pH值，35 ℃、180 r/min、裝液量50 mL、接種量6%進(jìn)行搖床培養(yǎng)18 h，測(cè)定不同起始pH值對(duì)搖床培養(yǎng)活菌數(shù)和OD值的影響，篩選出最佳起始pH值。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。

(3)接種量對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響[13]

接種量是影響發(fā)酵菌種生長(zhǎng)繁殖速度的重要因子，過多或過少都不利于發(fā)酵進(jìn)程的繼續(xù)。采用2%、4%、6%、8%四種不同接種量，35 ℃、180 r/min、裝液量50 mL、起始pH 7進(jìn)行搖床培養(yǎng)18 h，測(cè)定不同接種量對(duì)搖床培養(yǎng)活菌數(shù)和OD值的影響，篩選出最佳接種量。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。

(4)培養(yǎng)時(shí)間對(duì)枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響

采用12 h、16 h、20 h、24 h四種不同培養(yǎng)時(shí)間35 ℃、180 r/min、裝液量50 mL、起始pH 7、接種量6%進(jìn)行搖床培養(yǎng)，每隔一定時(shí)間測(cè)一次OD值同時(shí)進(jìn)行一次稀釋平板涂布，測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)搖床培養(yǎng)活菌數(shù)和OD值的影響，篩選出最佳培養(yǎng)時(shí)間。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。

1.2.6 響應(yīng)面優(yōu)化培養(yǎng)條件試驗(yàn)設(shè)計(jì)[14]

通過前期飼用枯草芽孢桿菌菌株菌體搖床培養(yǎng)條件優(yōu)化的單因素試驗(yàn)，來篩選出對(duì)菌液生長(zhǎng)相對(duì)明顯的因素作為 Plackett-Burman試驗(yàn)的研究因子，采用design-expert-10軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果處理。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 分離純化結(jié)果

經(jīng)分離純化獲得的菌株如圖1所示，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)得出稀釋平板涂布最佳梯度稀釋倍數(shù)為106倍。

圖1 分離純化平板圖

2.2 裝液量對(duì)飼用枯草芽孢桿菌OD600值的影響

不同搖瓶裝液量對(duì)飼用枯草芽孢桿菌OD600值的影響試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同裝液量與OD600值的對(duì)應(yīng)關(guān)系

由圖2可見，隨著裝液量的增加，發(fā)酵液菌體數(shù)量先上升后下降。當(dāng)250 mL搖瓶的裝液量為50 mL時(shí)，發(fā)酵液菌體OD600值最大，達(dá)到1.912。原因是液體含量越小，溶解氧系數(shù)越大。但當(dāng)液體的填充量太小，發(fā)酵過程中伴隨著水分的蒸發(fā)，活菌數(shù)量相應(yīng)減少。因此，選擇的裝液量為30 mL、50 mL、70 mL裝于250 mL錐形瓶中作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的三個(gè)水平。

2.3 起始pH值對(duì)飼用枯草芽孢桿菌OD600值的影響

不同起始pH值對(duì)飼用枯草芽孢桿菌OD600值的影響試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同起始pH值與OD600值的關(guān)系

圖3可見，不同起始pH值情況下，飼用枯草芽孢桿菌OD600值變化呈現(xiàn)先上升再下降的趨勢(shì)，當(dāng)初始pH值為7時(shí)，發(fā)酵液菌體OD600值達(dá)到最大，OD600值為1.912。初始pH值是發(fā)酵條件優(yōu)化的重要環(huán)節(jié)，適當(dāng)?shù)膒H值可以顯著提高發(fā)酵產(chǎn)量，pH值偏高或偏低都會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性的改變，從而會(huì)影響枯草芽孢桿菌對(duì)環(huán)境中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用。不同菌種的最適起始pH值不同，因此，選擇的起始pH值為6、7、8作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的三個(gè)水平。

2.4 接種量對(duì)飼用枯草芽孢桿菌OD600值的影響

不同接種量對(duì)飼用枯草芽孢桿菌OD600值的影響試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同接種量與OD600值的對(duì)應(yīng)關(guān)系

圖4可見，接種量由2%增加到6%時(shí)；搖瓶培養(yǎng)18 h，發(fā)酵液菌體OD600值逐漸增大，6%時(shí)達(dá)到1.912；但當(dāng)接種量為8%時(shí)，發(fā)酵液菌體數(shù)量下降，原因可能是高接種量引起溶解氧的不足，從而影響菌體的生長(zhǎng)代謝。接種量過多時(shí)，會(huì)引起溶解氧的不足，從而會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng)，菌株代謝產(chǎn)物的合成與積累也將受到抑制；接種量過少時(shí)，會(huì)使菌體的培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)，降低發(fā)酵生產(chǎn)效率。因此，選擇的接種量為4%、6%、8%接種于250 mL錐形瓶中作為響應(yīng)面設(shè)計(jì)的三個(gè)水平。

2.5 響應(yīng)面優(yōu)化法在培養(yǎng)條件優(yōu)化中的應(yīng)用

根據(jù) Plackett-Burman 試驗(yàn)篩選出顯著影響因素：裝液量(mL/mL，A)、接種量(%，B)、起始pH值(C)，以最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果中最大響應(yīng)值所對(duì)應(yīng)的各因素水平為基準(zhǔn)，確定響應(yīng)面的中心點(diǎn)[15]。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2所示。實(shí)驗(yàn)分析數(shù)據(jù)見表2在確定了最佳條件后，在此條件下進(jìn)行三次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，并結(jié)合實(shí)際條件確定了實(shí)際的最佳條件。響應(yīng)面試驗(yàn)是基于最陡爬升試驗(yàn)所選擇的中心點(diǎn)。響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表3。二次模型方差分析結(jié)果表明，R-Squared的值為0.963 0>0.9，并且Adj. R2的數(shù)值與R2接近，說明擬合分析值準(zhǔn)確可靠，采用中心組合設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化是可行的。PRESS小于0.05，說明組合模型具有差異顯著性。響應(yīng)面和等高線圖如圖6～圖11所示，自變量裝液量與起始pH值對(duì)OD值的交互影響對(duì)枯草芽孢桿菌活菌數(shù)和OD600的影響是顯著的。根據(jù)design-expert-10 軟件分析得出起始pH值為7、裝液量為50 mL/250 mL、接種量為6%，180 r/min搖床培養(yǎng)20 h可獲得最大活菌數(shù)2.89×109個(gè)。

表2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)回歸分析

2.5.1 裝液量與接種量對(duì)OD600值的交互影響

圖5可以看出不同裝液量和搖瓶接種量的之間有顯著影響。當(dāng)起始pH值不變時(shí)，隨著裝液量和搖瓶接種量的逐漸增加，枯草芽孢桿菌OD600(Y1)先上升后下降；在裝液量為50 mL左右時(shí)，搖瓶接種量為6%左右時(shí)，此時(shí)枯草芽孢桿菌OD600為最高。根據(jù)等高線可以分析得出，當(dāng)裝液量不變時(shí)，從搖瓶接種量的變化趨勢(shì)看時(shí)，可觀察到裝液量的等高線比較密集。表明裝液量相對(duì)于搖瓶接種量對(duì)OD600的影響較顯著。

圖5 裝液量與接種量相互影響的曲面圖及等高線圖

2.5.2 裝液量與起始pH值對(duì)OD600值的交互影響

圖6可以看出不同裝液量和起始pH值的之間有顯著影響。當(dāng)起始搖瓶裝液量不變時(shí)，隨著裝液量和起始pH值的逐漸增加，枯草芽孢桿菌OD600(Y1)先上升后下降；在裝液量為50 mL左右時(shí)，起始pH值為7左右時(shí)，此時(shí)枯草芽孢桿菌OD600為最高。根據(jù)等高線可以分析得出，當(dāng)裝液量不變時(shí)，從起始pH值的變化趨勢(shì)看時(shí)，可觀察到裝液量的等高線比較密集。同時(shí)起始pH值不變時(shí)，從裝液量的變化趨勢(shì)可以看出起始pH值的等高線比較密集，表明裝液量和起始pH值對(duì)OD600的影響都比較顯著。

圖6 裝液量與起始pH值相互影響的曲面圖及等高線圖

2.5.3 接種量與起始pH值對(duì)OD600值的交互影響

圖7可以看出不同搖瓶接種量和起始pH值的之間有顯著影響。當(dāng)起始搖瓶裝液量不變時(shí)，隨著裝液量和起始pH值的逐漸增加，枯草芽孢桿菌OD600(Y1)先上升后下降；在接種量為6%左右時(shí)，起始pH值為7左右時(shí)，此時(shí)枯草芽孢桿菌OD600為最高。根據(jù)等高線可以分析得出，當(dāng)起始pH值不變時(shí)，從搖瓶接種量的變化趨勢(shì)可以看出起始pH值的等高線比較密集，表明起始pH值相對(duì)于搖瓶裝液量對(duì)OD600的影響較顯著。

圖7 接種量與起始pH值相互影響的曲面圖及等高線圖

2.5.4 裝液量與接種量對(duì)活菌數(shù)交互影響

圖8可以看出不同裝液量和搖瓶接種量的之間有顯著影響。當(dāng)起始pH值不變時(shí)，隨著裝液量和搖瓶接種量的逐漸增加，枯草芽孢桿菌活菌數(shù)(Y2)先上升后下降；在裝液量為50 mL左右時(shí)，搖瓶接種量為6%左右時(shí)，此時(shí)枯草芽孢桿菌活菌數(shù)為最高。根據(jù)等高線可以分析得出，當(dāng)裝液量不變時(shí)，從搖瓶接種量的變化趨勢(shì)看時(shí)，可觀察到裝液量的等高線比較密集。表明裝液量相對(duì)于搖瓶接種量對(duì)活菌數(shù)的影響較顯著。

圖8 裝液量與接種量相互影響的曲面圖及等高線圖

2.5.5 裝液量與起始pH值對(duì)活菌數(shù)交互影響

圖9可以看出不同裝液量和起始pH值的之間有顯著影響。當(dāng)起始搖瓶裝液量不變時(shí)，隨著裝液量和起始pH值的逐漸增加，枯草芽孢桿菌活菌數(shù)(Y2)先上升后下降；在裝液量為50 mL左右時(shí)，起始pH值為7左右時(shí)，此時(shí)枯草芽孢桿菌活菌數(shù)為最高。根據(jù)等高線可以分析得出，當(dāng)裝液量不變時(shí)，從起始pH值的變化趨勢(shì)看時(shí)，可觀察到裝液量的等高線比較密集。同時(shí)起始pH值不變時(shí)，從裝液量的變化趨勢(shì)可以看出起始pH值的等高線比較密集，表明裝液量和起始pH值對(duì)活菌數(shù)的影響都比較顯著。

圖9 裝液量與起始pH值相互影響的曲面圖及等高線圖

2.5.6 接種量與起始pH值對(duì)活菌數(shù)交互影響

圖10可以看出不同搖瓶接種量和起始pH值的之間有顯著影響。當(dāng)起始搖瓶裝液量不變時(shí)，隨著裝液量和起始pH值的逐漸增加，枯草芽孢桿菌活菌數(shù)(Y2)先上升后下降；在接種量為6%左右時(shí)，起始pH值為7左右時(shí)，此時(shí)枯草芽孢桿菌活菌數(shù)為最高。根據(jù)等高線可以分析得出，當(dāng)起始pH值不變時(shí)，從搖瓶接種量的變化趨勢(shì)可以看出起始pH值的等高線比較密集，表明起始pH值相對(duì)于搖瓶裝液量對(duì)活菌數(shù)的影響較顯著。

圖10 接種量與起始pH值相互影響的曲面圖及等高線圖

3 結(jié) 論

本研究采用單因素優(yōu)化確定幾種不同影響因素最佳值，然后采用Box-Benhnken 設(shè)計(jì)的方法，并且利用design-expert-10 軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)分析，是分析優(yōu)化飼用枯草芽孢桿菌培養(yǎng)條件的有效途徑[17]。結(jié)合搖瓶裝液量、接種量和初始pH值三個(gè)主要因素，利用響應(yīng)面法建立了芽孢桿菌液體發(fā)酵產(chǎn)孢的擬合數(shù)學(xué)模型，方程如下：

以O(shè)D值為響應(yīng)值的二次方程：

以活菌數(shù)為響應(yīng)值的二次方程：

優(yōu)化后得到搖床培養(yǎng)最佳條件為：接種量6%、裝液量50 mL/250 mL、起始pH值為7、溫度35 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min。此條件下獲得活菌數(shù)和OD600值為最高，活菌數(shù)達(dá)2.89×109；OD600值達(dá)1.936。本實(shí)驗(yàn)研究的飼用枯草芽孢桿菌搖床培養(yǎng)條件優(yōu)化，對(duì)后續(xù)菌種保藏上架都有一定的參考價(jià)值。因此，發(fā)酵工藝參數(shù)的優(yōu)化和改進(jìn)的研究還有待于進(jìn)一步開展。