大孔吸附樹脂純化西蘭花色素的研究

李云志，金志峰

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥230045）

隨著生活水平的提高，人們對(duì)飲食的要求也逐漸提高，富有營(yíng)養(yǎng)、保健作用和色香味俱全的食品成為大家的首選。色素是一類重要的食品添加劑，可以達(dá)到改善食品的色澤，增進(jìn)食品感官性質(zhì)的作用。目前，在食品工業(yè)上廣泛使用的色素主要分為天然色素和人工合成色素兩類。天然色素來自于自然界，除了具有基本的著色作用以外，很多還具有一定的生理活性[1-2]。因此，從自然界中獲取天然色素已成為食用色素發(fā)展的必然趨勢(shì)[3-4]。

西蘭花，屬十字花科蕓苔屬甘藍(lán)變種，又名綠菜花、青花菜，營(yíng)養(yǎng)豐富，被譽(yù)為“蔬菜皇冠”。其食用部分為綠色幼嫩花莖和花蕾，不僅含有蛋白質(zhì)、糖、脂肪、維生素和胡蘿卜素等常見的營(yíng)養(yǎng)成分，而且還含有一定量類黃酮物質(zhì)[5]。類黃酮是一類植物色素，具有多樣的生理活性，如抗氧化、抗炎、抗腫瘤、保肝等作用，可以作為食品、化妝品的天然添加劑[6]。因此，利用西蘭花提取食用色素，對(duì)食品資源的綜合開發(fā)利用，新型食用色素的研發(fā)具有重要意義。大孔樹脂是一類不帶離子交換基團(tuán)的多孔型交聯(lián)聚合物，近年來廣泛應(yīng)用于天然活性成分的純化研究，并取得了較好的效果[7-14]。因此，本實(shí)驗(yàn)擬采用大孔樹脂研究西蘭花色素的純化工藝，為其開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西蘭花 市購(gòu)；95%乙醇 為國(guó)產(chǎn)分析純；AB-8、DM-130、D1300、NKA-9、HPD-300型大孔吸附樹脂 安徽三星樹脂公司。

722型紫外可見分光光度計(jì) 上海菁華科技有限公司；BSA2201-CW型電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；SHZ-D型循環(huán)水式真空泵 鞏義市英山谷予華儀器廠；DZF-6090型真空干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 無錫沃信儀器有限公司；DKZ-2B型電熱恒溫振蕩水槽 上海恒勤科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大孔樹脂預(yù)處理 大孔樹脂裝柱，用95%乙醇浸泡24h，再用95%乙醇以2BV/h的流速（1BV為一個(gè)樹脂床體積）通過樹脂層，洗至流出液加蒸餾水不呈白色渾濁為止，再用去離子水洗至pH為中性。

1.2.2 西蘭花粗色素制備及定性鑒別 稱取500g的西蘭花，除雜、研磨破碎，按1g∶5m L的比例加入60%的乙醇溶液，滴加鹽酸，調(diào)節(jié)pH 3.0，40℃水浴2h，抽濾，40℃下減壓濃縮濾液得到浸膏，最后真空干燥得到粗色素。然后采用經(jīng)典的鹽酸-鎂粉實(shí)驗(yàn)對(duì)提取物進(jìn)行定性鑒別，以確定其是否為黃酮類化合物[15]。

1.2.3 色素色價(jià)的測(cè)定方法[4]準(zhǔn)確稱取色素1g，用pH 3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液稀釋至1000m L，配制成色素原液；吸取10m L原液，用緩沖液稀釋至100m L，測(cè)定最大吸收波長(zhǎng)，并在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定其Abs值，用式（1）計(jì)算色價(jià)。

式中，S：總色價(jià)（A/g）；A：吸光度；W：原料質(zhì)量（g）；V1：提取液體積（m L）；V2：取樣體積（m L）；n：取樣稀釋倍數(shù)。

1.2.4 靜態(tài)吸附

1.2.4.1 吸附率和解析率的計(jì)算 用濾紙吸干預(yù)處理后的大孔樹脂，準(zhǔn)確稱取各0.5g，加入具塞三角瓶；稱取0.5g色素，用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液（pH3.0）1000m L配制成溶液，測(cè)定吸光度A0；各取50m L色素溶液加入裝有大孔樹脂的三角瓶，置于恒溫振蕩器振蕩24h（30℃，150r/m in），過濾，測(cè)定濾液的吸光度A1；過濾后的吸附色素的大孔樹脂，分別加入50m L 90%乙醇，置30℃和150r/m in恒溫振蕩器中振蕩24h，過濾，測(cè)定濾液中色素的吸光度（A2），按下式計(jì)算解吸率。

以吸附率與解析率為指標(biāo)，選取吸附率與解析率高的大孔樹脂進(jìn)行下述工藝參數(shù)研究。

1.2.4.2 pH對(duì)大孔樹脂吸附的影響 量取上述色素原液6份，每份50m L，調(diào)節(jié)pH分別為2.2、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0；準(zhǔn)確稱取6份選定的大孔樹脂，每份0.5g，分別加入色素溶液，30℃150r/m in振蕩60m in，過濾，測(cè)濾液吸光度，計(jì)算吸附率。

1.2.4.3 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)研究 準(zhǔn)確稱取預(yù)處理后的大孔樹脂0.5g，置于具塞三角瓶中，加入50m L色素溶液，置50℃恒溫振蕩器，150r/m in振蕩，每隔10m in移取1m L溶液，用95%乙醇定容至5m L，測(cè)定吸光度，繪制靜態(tài)動(dòng)力學(xué)曲線。

1.2.4.4 溫度對(duì)大孔樹脂吸附的影響 準(zhǔn)確稱取6份大孔樹脂，每份0.5g，各加入色素溶液50m L，分別在20、30、40、50、60、70℃下恒溫振蕩70m in（150r/m in），每隔10m in測(cè)色素溶液在最大吸收波長(zhǎng)處的吸光度，作吸附率隨時(shí)間的變化曲線。

1.2.4.5 解析液體積分?jǐn)?shù)對(duì)大孔樹脂解吸的影響 稱取6份經(jīng)吸附飽和的AB-8大孔樹脂，每份0.5g，分別加入50m L體積分?jǐn)?shù)為20%、35%、50%、65%、80%、95%的乙醇水溶液，在水浴振蕩器上振蕩（30℃，150r/m in）60min，過濾，測(cè)定濾液的吸光度。

1.2.5 大孔樹脂的動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn) 取上述選定的大孔樹脂10g，裝入直徑為1.2cm的層析柱，進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附與解析實(shí)驗(yàn)，考察上樣液濃度、流速以及解析液流速對(duì)吸附與解析的影響。

1.2.5.1 上樣液濃度對(duì)吸附的影響 配制質(zhì)量濃度0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/m L，pH 4.0的色素溶液，以1.0m L/m in流速上樣，每5m L收集一次流分，測(cè)流出液吸光度。當(dāng)流出液的吸光度達(dá)到上樣液的10%時(shí)，為泄露點(diǎn)，停止上樣，根據(jù)上樣液體積與濃度計(jì)算吸附率。

1.2.5.2 上樣液流速對(duì)吸附的影響 配制1.2.5.1最佳上樣液濃度、pH4.0的色素溶液，分別以0.5、1.0、2.0、3.0m L/m in流速流過樹脂，每5m L收集一次流分，測(cè)其吸光度。當(dāng)流出液的吸光度達(dá)到上樣液的10%時(shí)，為泄露點(diǎn)，停止上樣，根據(jù)上樣液體積與濃度計(jì)算吸附率。

1.2.5.3 解吸液流速對(duì)解吸的影響 配制pH 4.0的色素溶液流經(jīng)樹脂直至達(dá)到飽和，然后用3BV蒸餾水洗柱，再以1.2.4.5確定的最佳濃度洗脫液分別在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5m L/min流速下洗脫，5m L收集一管，測(cè)其吸光度，當(dāng)吸光度為零時(shí)停止洗脫。

1.2.6 實(shí)際吸附解析實(shí)驗(yàn) 以上述最佳參數(shù)上樣，每5m L收集一次流分，測(cè)吸光度，當(dāng)流出液吸光度為上樣液吸光度的1/10時(shí)，停止上樣；然后以3BV的蒸餾水洗柱，再以1.2.4.5確定的洗脫液最佳濃度、以1.2.5.3確定的最佳流速及洗脫體積洗脫，合并洗脫液，真空濃縮，測(cè)定色價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 西蘭花色素的定性鑒別

采用經(jīng)典的鹽酸-鎂粉實(shí)驗(yàn)測(cè)定所提取的色素是否為黃酮類化合物，結(jié)果顯示陽(yáng)性反應(yīng)，因此所提取的成分為黃酮類化合物。

2.2 大孔樹脂靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)

2.2.1 西蘭花色素在不同大孔樹脂上的吸附及解吸率 實(shí)驗(yàn)采用的5種樹脂對(duì)西蘭花色素的靜態(tài)吸附率和解析率如表1所示，結(jié)果顯示AB-8在5種大孔樹脂中吸附率最高，DM-130、D1300次之，HPD-300、NKA-9最低；AB-8的解析率在所研究樹脂中最高。因此，AB-8樹脂對(duì)西蘭花色素具有較好的選擇性，后續(xù)實(shí)驗(yàn)以該樹脂為研究對(duì)象，考察其靜動(dòng)態(tài)吸附與解析性能。

表1 色素在不同大孔樹脂上的吸附及解吸率Table1 Adsorption rate and deadsorption rate of differentmacroporous resin

2.2.2 pH對(duì)AB-8大孔樹脂吸附的影響 在pH分別為2.2、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0的條件下，AB-8大孔樹脂對(duì)西蘭花色素的吸附率如表2所示。結(jié)果顯示，pH= 4.0時(shí)AB-8樹脂對(duì)西蘭花色素的吸附率最高。

表2 不同pH條件下AB-8的吸附率Table2 Adsorption rate of AB-8 under different pH conditions

2.2.3 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)特征曲線 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)是樹脂的重要性能參數(shù)。由圖1可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，AB-8樹脂吸附后色素溶液的吸光度呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，當(dāng)吸附50m in以后，吸光度已基本沒有變化，表明在此時(shí)間點(diǎn)吸附劑已經(jīng)基本吸附飽和。

圖1 AB-8的靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 Static adsorption curve of AB-8

2.2.4 溫度對(duì)吸附的影響 溫度對(duì)大孔樹脂的吸附有一定的影響。由圖2可知，在前40min，吸附率隨著溫度的升高而升高，在40min以后，隨著溫度的提高，60、70℃的吸附率反而不如50℃的吸附率，顯示溫度太高反而不利于吸附。綜合考慮，50℃為較為適宜的吸附溫度。

圖2 不同溫度條件下的吸附率Fig.2 Adsorption rate under different temperature conditions

2.2.5 解析液體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸的影響 不同體積分?jǐn)?shù)的解析液，其極性不同，對(duì)吸附在大孔樹脂上的有機(jī)物的解析能力不一樣，所以有必要考察解析液體積分?jǐn)?shù)對(duì)解析的影響。實(shí)驗(yàn)采用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇（20%、35%、50%、65%、80%、95%）進(jìn)行洗脫，結(jié)果如圖3所示。實(shí)驗(yàn)顯示隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，AB-8大孔樹脂對(duì)西蘭花色素的解析率逐漸增高，但到80%時(shí)已基本不變，和95%基本持平，顯示西蘭花色素適宜于高濃度的乙醇洗脫。為節(jié)省成本，在洗脫時(shí)選擇80%體積分?jǐn)?shù)的乙醇作為洗脫液較為適宜。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)解吸的影響Fig.3 Effectof concentration of ethanol on deadsorption

2.3 大孔樹脂的動(dòng)態(tài)吸附

2.3.1 上樣液濃度對(duì)吸附的影響 上樣液濃度對(duì)吸附具有一定的影響，為考察上樣液濃度與吸附量的關(guān)系，取不同濃度的上樣液（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/m L）以達(dá)到泄露點(diǎn)為終點(diǎn)進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附研究。結(jié)果（圖4）顯示隨著上樣液濃度的增加，吸附量隨之增加，濃度在2.5mg/m L的上樣液的吸附量達(dá)到最大，但是進(jìn)一步增高濃度后，吸附量反而有下降的趨勢(shì)，其原因是色素分子與樹脂之間的吸附需要一定的平衡時(shí)間，濃度太高，泄露點(diǎn)提前，反而不利于吸附。

圖4 上樣液濃度與吸附量的關(guān)系Fig.4 The relation between sample concentration and adsorption

2.3.2 上樣液流速對(duì)吸附的影響 上樣液的流速對(duì)吸附量有一定的影響，上樣液濃度一定，流速越快，泄露的越快。因此，有必要考察上樣液流速對(duì)吸附的影響，實(shí)驗(yàn)取上樣液流速分別為0.5、1、2、3m L/m in，結(jié)果如圖5。由圖5可知，隨著進(jìn)樣流速的增大，樹脂的吸附量降低。當(dāng)流速為0.5m L/m in時(shí)，吸附量最大；當(dāng)進(jìn)樣流速為1.0m L/m in時(shí)，吸附量與流速為0.5m L/m in時(shí)相近?？紤]到流速低，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，生產(chǎn)效率低，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，進(jìn)樣流速為1.0m L/m in較合適。

2.3.3 洗脫液流速對(duì)解吸的影響 為考察洗脫液流速對(duì)解析的影響，實(shí)驗(yàn)采用不同流速的80%乙醇作為洗脫液進(jìn)行洗脫，每5m L測(cè)定一次吸光度，結(jié)果如圖6所示。實(shí)驗(yàn)顯示洗脫液流速1.0m L/m in時(shí)，流出液的吸光度最早達(dá)到最低，40m L體積（4BV）的洗脫液基本將色素洗脫完全。

圖5 上樣液流速對(duì)吸附的影響Fig.5 Effectof sample loading flow rate on adsorption

圖6 洗脫液流速對(duì)解吸的影響Fig.6 Effectof eluate flow rate on deadsorption

2.3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇上樣液濃度2.5mg/m L、流速1.0m L/min、pH 4.0、溫度50℃上樣，達(dá)到漏點(diǎn)后，用3BV的去離子水洗柱，然后用80%的乙醇以1.0m L/m in的流速洗脫，洗脫液每5m L一管，洗脫4BV。在此參數(shù)下，西蘭花色素色價(jià)由純化前的23.7提高到91.7。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)選取5種不同極性的大孔樹脂，以對(duì)西蘭花色素的吸附率和解吸率為指標(biāo)，篩選出對(duì)西蘭花色素具有選擇性吸附的樹脂。結(jié)果表明，AB-8樹脂對(duì)西蘭花色素不僅吸附量大而且解吸率高，適合用于西蘭花色素的分離和富集。以上樣液濃度2.5mg/m L、流速1.0m L/min、pH4.0、溫度50℃上樣；用80%的乙醇以1.0m L/m in的流速，洗脫4BV后，色素的色價(jià)有大幅度的提高，由純化前的23.7提高到91.7。

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