免疫親和柱的制備及在真菌毒素檢測(cè)中應(yīng)用的研究進(jìn)展

袁 藝，陸廷瑾，沈騰騰，秦學(xué)磊，劉 瑩，焦志培，廖驚殊，張東升，*

（1.江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇無(wú)錫214013；2.河南省糧油飼料產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，河南鄭州450003；3.湖南中儲(chǔ)糧質(zhì)量檢測(cè)中心，湖南寧鄉(xiāng)410600）

真菌毒素是真菌的次生代謝產(chǎn)物，它會(huì)引起人和動(dòng)物的急性和慢性中毒[1]。產(chǎn)生真菌毒素的真菌屬有黃曲霉屬、鐮刀菌屬和青霉菌屬等。其中對(duì)人類(lèi)危害最大、研究最多的真菌毒素有：黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、伏馬毒素和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。許多作物在生長(zhǎng)、收割、干燥和貯藏期間已經(jīng)被真菌毒素所污染。谷物、堅(jiān)果、乳制品和棉籽等都比較容易被真菌毒素污染[2]。調(diào)查研究表明全球至少100個(gè)國(guó)家均存在食品被毒素污染的情況，大多數(shù)都是被黃曲霉毒素所污染，不同國(guó)家的限定標(biāo)準(zhǔn)也不一樣[3]。

常見(jiàn)的分析檢測(cè)真菌毒素的方法包括薄層層析（TLC）、高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC）、質(zhì)譜分析（MS）和酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）等。TLC法由于設(shè)備簡(jiǎn)單，易于普及，所以國(guó)內(nèi)外仍在使用，但該法樣品前處理繁瑣，且提取和凈化效果不夠理想，提取液中雜質(zhì)較多，在展開(kāi)時(shí)影響斑點(diǎn)的熒光強(qiáng)度。而雙向展開(kāi)雖避免了雜質(zhì)干擾，但增加了操作步驟和時(shí)間[4]。ELISA方法簡(jiǎn)便快捷，但是由于提取處理不凈，基質(zhì)中雜質(zhì)干擾，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。

近幾年來(lái)，免疫親和層析柱已被廣泛應(yīng)用于真菌毒素的凈化處理[5]。免疫親和柱凈化處理方法可選擇性地將真菌毒素從提取液中分離出來(lái)，提高了熒光分析的靈敏性，降低檢測(cè)限[2]。與其他提取方法比較，免疫親和柱的前處理凈化技術(shù)還有其他優(yōu)勢(shì)。主要表現(xiàn)：a.提取時(shí)避免使用有毒有機(jī)溶劑，減少對(duì)操作人員的損害；b.方便快捷，簡(jiǎn)化了前處理步驟；c.由于凈化處理徹底，減少了基質(zhì)中的雜質(zhì)干擾，數(shù)據(jù)更加可靠。本文對(duì)免疫親和柱的原理和制備方式進(jìn)行了介紹，并且針對(duì)幾種常見(jiàn)的真菌毒素，綜述了免疫親和柱凈化技術(shù)在這幾種真菌毒素檢測(cè)分析上的應(yīng)用。

1 免疫親和柱原理

向親和柱空柱管內(nèi)裝0.2～0.5m L凝膠，其中分析物的抗體（單克隆抗體或多克隆抗體）已經(jīng)固定在凝膠上。先用PBS緩沖液沖洗柱子，使樣品粗提液緩慢通過(guò)柱子，控制流速1～2m L/m in。提取液隨著重力或者注射器推動(dòng)下，緩慢流出親和柱，再用PBS沖洗去除填料上的雜質(zhì)，最后通過(guò)破壞抗原抗體之間的鍵，目標(biāo)物從柱子上被洗脫下來(lái)。對(duì)于小分子來(lái)說(shuō)，可以用少量的甲醇或者乙腈來(lái)完成。洗脫大分子需要酸性條件[6]。也可以用含有NaCl的甘氨酸緩沖液洗脫分析物[7-8]，這樣會(huì)減小對(duì)抗體的破壞。

值得注意的是樣品提取液一般是水溶性的，有機(jī)溶劑會(huì)破壞抗體，干擾抗原抗體相互作用。抗體特異性、抗原結(jié)合強(qiáng)度（動(dòng)態(tài)結(jié)合能力）、抗體的位點(diǎn)總數(shù)，均會(huì)對(duì)回收率產(chǎn)生影響。樣品提取的體積也是限定因素，凈化大體積的提取液可能產(chǎn)生較長(zhǎng)的操作時(shí)間。對(duì)于液體樣品，比如說(shuō)牛奶，啤酒，葡萄酒，醋還有醬油，可以直接通過(guò)免疫親和柱，而不需要前處理提取。

2 免疫親和柱制備方式

目前制備免疫親和柱通常是選用一種載體，將IgG抗體與載體偶聯(lián)，制備成相應(yīng)的免疫親和柱。親和介質(zhì)的制備過(guò)程涉及載體的選擇、空白介質(zhì)活化、配基偶聯(lián)、封閉未偶聯(lián)位點(diǎn)，以及清洗保存等步驟，其中介質(zhì)活化及配基偶聯(lián)過(guò)程是影響介質(zhì)性能的關(guān)鍵。親和柱載體的選擇有多種，常用的載體有瓊脂糖凝膠、纖維素以及一些合成的有機(jī)基體（如聚丙烯酰胺凝膠和聚乙烯凝膠等）。為了使基體更適于HPLC分析，人們正積極研發(fā)新型的基體材料。這類(lèi)基體主要有硅膠、玻璃及某些有機(jī)物的衍生物。該類(lèi)基體的高效能和機(jī)械穩(wěn)定性使其用于HPLC系統(tǒng)時(shí)，提高了分析的速度和精密度[9]。

基質(zhì)活化通常在骨架上引入強(qiáng)親電基團(tuán)，然后與抗體上親核基團(tuán)如-NH2、-OH、-SH等發(fā)生取代反應(yīng)，使抗體連接于基質(zhì)上[10]。常用的介質(zhì)活化方式包括環(huán)氧活化、溴化氰活化以及戊二醛活化等，溴化氰活化的瓊脂糖是通常選用的親和柱載體材料[11]。孫興榮等[12]應(yīng)用溴化氰激活的Sepharose 4B，制備了黃曲霉毒素M 1污染樣品的凈化前處理免疫親和柱，裝柱后通過(guò)ELISA對(duì)免疫親和柱的性能評(píng)價(jià)確立了最佳反應(yīng)條件，平均回收率為92.46%，變異系數(shù)2.3%～7.2%。張燦等[13]以硅膠作為載體制備的氯霉素免疫親和柱對(duì)氯霉素抗體的偶聯(lián)率達(dá)到72%，能有效的對(duì)樣品中痕量殘留的氯霉素進(jìn)行純化富集，硅膠相比于瓊脂糖凝膠，性?xún)r(jià)比高，耐壓性較強(qiáng)，是一種良好的免疫親和柱載體。

抗體與活化基體的偶聯(lián)方式有隨機(jī)偶聯(lián)與定向偶聯(lián)兩種，隨機(jī)偶聯(lián)時(shí)，基體與抗體的結(jié)合位點(diǎn)不固定，這是因?yàn)殡S機(jī)偶聯(lián)時(shí)，抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)可能被占用，或者擠占了抗原結(jié)合位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致與抗體失去親合力。因此，隨機(jī)偶聯(lián)后的IAC免疫活性一般較低。定向偶聯(lián)是先將protein A或protein G固定在基體上，protein A或protein G只與IgG的Fc區(qū)相結(jié)合，然后用二甲基庚二酸酯等化學(xué)交聯(lián)劑使抗體（多抗或單抗）與protein A或protein G定向偶聯(lián)，抗體上的抗原結(jié)合位點(diǎn)則處于游離狀態(tài)[9]。黃昕等[14]的實(shí)驗(yàn)研究表明使用protein A的定向偶聯(lián)抗原結(jié)合容量是隨機(jī)偶聯(lián)的1.8倍，說(shuō)明定向偶聯(lián)有助于提高免疫親和吸附劑的抗原結(jié)合容量。

3 免疫親和柱在真菌毒素檢測(cè)分析前處理上的應(yīng)用

3.1 黃曲霉毒素

黃曲霉毒素在食品和飼料上的污染問(wèn)題已經(jīng)成為近30年人們廣泛關(guān)注的問(wèn)題。該毒素是一組由黃曲霉屬真菌在作物生長(zhǎng)期間產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物。當(dāng)溫度和濕度條件適宜，這些真菌就能在食品和動(dòng)物飼料中生長(zhǎng)。黃曲霉毒素對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物都有很大的危害，可以導(dǎo)致癌變、畸形和突變。

選用適宜的方法測(cè)定食品中的黃曲霉毒素已經(jīng)逐漸成為研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。Ardic等[5]采用免疫親和柱與ELISA結(jié)合的方法測(cè)定土耳其市場(chǎng)上75個(gè)胡椒粉樣品，其中72個(gè)樣品中黃曲霉B1的范圍在0.11～24.7μg/kg之間，11個(gè)高于國(guó)家黃曲霉限量標(biāo)準(zhǔn)。楊小麗等[15]測(cè)定動(dòng)物類(lèi)藥材中黃曲霉毒素時(shí)，樣品經(jīng)過(guò)甲醇-水提取后，通過(guò)免疫親和柱凈化，柱后光化學(xué)衍生，HPLC-熒光檢測(cè)器測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，回收率為78.8%～106.7%。這種方法靈敏度高、重現(xiàn)性好，適合動(dòng)物藥材中黃曲霉毒素的快速定量分析。2003年由國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局發(fā)布并實(shí)施的《食品中黃曲霉毒素的測(cè)定免疫親和層析凈化高效液相色譜法和熒光光度法》（GB/T 18979-2003），首次將免疫親和層析柱作為凈化黃曲霉毒素的標(biāo)準(zhǔn)方法[16]。2010年由中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部發(fā)布并實(shí)施的《乳和乳制品中黃曲霉毒素M1的測(cè)定》，要求將免疫親和層析柱凈化作為L(zhǎng)C-MS、LC、熒光分光度法的前處理手段[17]。

3.2 赭曲霉毒素

赭曲霉毒素（OTA）是一種由曲霉屬真菌和青霉屬真菌在不同環(huán)境條件下產(chǎn)生的一種真菌毒素。OTA可以存在于不同的產(chǎn)品中，比如說(shuō)谷物、調(diào)料、咖啡、牛奶、啤酒以及一些豬的血液和腎臟中，可引起動(dòng)物的腎臟肝臟腫瘤等疾病[18-23]。

其測(cè)定方法也有多種，如基于反相柱的HPLC方法，離子遷移色譜[24]，熒光檢測(cè)方法，HPLC和質(zhì)譜聯(lián)用等方法[25]。大多數(shù)方法都是利用固相柱凈化提取和親和層析技術(shù)去除雜質(zhì)，可避免測(cè)定毒素時(shí)雜質(zhì)的干擾。

免疫親和柱與LC-MS可以聯(lián)合用于測(cè)定咖啡飲料中OTA的含量。Noba等[26]用免疫親和柱前處理凈化提取，LC-MS確定OTA含量，加標(biāo)量為0.1ng/m L，回收率為97.3%，RSD為1.9%，同時(shí)抽檢日本市場(chǎng)上30個(gè)咖啡飲料樣品用此種方法分析，OTA含量從0.002ng/mAL到0.037ng/m L，此方法目前已被證明可以準(zhǔn)確的用于測(cè)定咖啡飲料中的OTA含量。酒日漸成為各個(gè)國(guó)家消耗量最大的一種常用食品，也是容易被OTA污染的主要食品之一。測(cè)定酒中OTA的方法無(wú)疑都要用到有毒試劑來(lái)提取，步驟繁瑣。Visconti等[27]使用免疫親和柱凈化和HPLC-熒光法確定酒中赭曲霉毒素的含量，白酒、紅酒樣品中的OTA水平從0.04到10ng/m L，平均回收率為88%～103%。由于免疫親和柱是基于抗體的特異性?xún)艋崛?，所以?shí)驗(yàn)方便分析，節(jié)省時(shí)間。2009年由國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局及標(biāo)委會(huì)發(fā)布并實(shí)施的《食品中赭曲霉毒素A的測(cè)定免疫親和層析凈化高效液相色譜法》（GB/T 23502-2009），將免疫親和層析柱作為凈化赭曲霉毒素A的標(biāo)準(zhǔn)方法[28]。

3.3 伏馬毒素

伏馬毒素（FB）是一組主要由串珠鐮刀菌在一定溫度和濕度條件下繁殖產(chǎn)生的真菌毒素。它是一類(lèi)由不同的多氫醇和丙三羧酸組成的結(jié)構(gòu)類(lèi)似的雙酯化合物，其中FB1、FB2是主要組分，在世界范圍內(nèi)均被發(fā)現(xiàn)，主要存在于玉米中，能夠?qū)τ衩准捌渲破吩斐晌廴尽?/p>

伏馬毒素的檢測(cè)方法有HPLC法、TLC和ELISA等。隨著免疫親和柱凈化方法在黃曲霉毒素檢測(cè)上被廣泛應(yīng)用，一些研究者在測(cè)定食品中的伏馬毒素時(shí)也采用免疫親和柱凈化與HPLC、TLC聯(lián)用的檢測(cè)手段，發(fā)現(xiàn)其檢測(cè)靈敏，避免了雜質(zhì)干擾。Girolamo等[29]采用免疫親和柱與HPLC聯(lián)用的方法測(cè)定嬰兒玉米食品中的伏馬毒素B1與B2，在55℃萃取，免疫親和柱凈化，HPLC檢測(cè)，樣品加標(biāo)濃度為80～800μg/kg FB1和20～200μg/kg FB2，平均回收率范圍FB1從83%到97%，F(xiàn)B2范圍從61%到78%，檢測(cè)限為FB12.8μg/kg，F(xiàn)B22.2μg/kg。2010年由國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局及標(biāo)委會(huì)發(fā)布并實(shí)施的《糧油檢驗(yàn)玉米及其制品中伏馬毒素含量測(cè)定免疫親和層析凈化高效液相色譜法和熒光光度法》（GB/T 25228-2010），將免疫親和層析柱作為凈化伏馬毒素的標(biāo)準(zhǔn)方法[30]。

3.4 玉米赤霉烯酮

玉米赤霉烯酮（ZEN）是一種由鐮刀菌屬產(chǎn)生的廣泛分布的真菌毒素，是導(dǎo)致谷物疾病的主要因素。該毒素主要存在于玉米中，但是發(fā)現(xiàn)其也會(huì)存在于小麥、大麥和高粱中。

目前分析檢測(cè)玉米赤霉烯酮方法包括薄層層析法[31]，GC-MS分析[32]和HPLC[33]等，盡管這幾種方法檢測(cè)限低，但是它們耗時(shí)，使用溶劑量大，這時(shí)就需要一種或多種凈化處理步驟。

Trucksess等[34]用HPLC-與免疫親和柱凈化檢測(cè)日常食用的大豆、谷物和谷物產(chǎn)品中的玉米赤霉烯酮的含量，樣品用75%甲醇-水提取，離心，用免疫親和柱凈化，接著用HPLC-熒光測(cè)定，樣品中ZEN含量小于10mg/kg，對(duì)于所有的實(shí)驗(yàn)樣本，同批次間的回收率從82%～88%，不同批次間的從81%～84%。使用這種免疫親和柱凈化可使HPLC檢測(cè)更靈敏，更快速和簡(jiǎn)便。2009年由國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局及標(biāo)委會(huì)發(fā)布并實(shí)施的《食品中玉米赤霉烯酮的測(cè)定免疫親和層析凈化高效液相色譜法》（GB/T 18979-2003），將免疫親和層析柱作為凈化玉米赤霉烯酮的標(biāo)準(zhǔn)方法[35]。

3.5 脫氧雪腐鐮刀烯醇

脫氧雪腐鐮刀烯醇（DON）是谷物中最常見(jiàn)的單端孢霉烯化合物，主要由禾谷鐮刀菌和黃色鐮刀菌產(chǎn)生。這些真菌會(huì)在農(nóng)作物中生長(zhǎng)，比如說(shuō)玉米、小麥、大麥、燕麥和黑小麥。DON對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物都有害，會(huì)誘發(fā)多種疾病，使神經(jīng)信號(hào)改變，破壞激素軸，使腸道發(fā)生病變[36]。動(dòng)物吃過(guò)被DON污染的飼料后會(huì)引起嘔吐和腹瀉。長(zhǎng)期接觸DON也會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)遲緩，激發(fā)或者抑制免疫系統(tǒng)[37]。

隨著飼料和食物中DON濃度的限量，一些高效確定DON的分析方法逐漸發(fā)展起來(lái)。目前有多種方法可以確定復(fù)雜基質(zhì)中的DON含量，如酶聯(lián)免疫吸附、熒光偏振免疫分析，還有一些層析的方法，比如說(shuō)薄層層析、氣相層析或者是質(zhì)譜分析、HPLC-紫外檢測(cè)、柱后衍生-熒光檢測(cè)。盡管使用了一些選擇性分離和靈敏的檢測(cè)方法，但是還只在預(yù)處理步驟之后才能檢測(cè)出食品和飼料中的DON。現(xiàn)在炭/氧化鋁柱和免疫親和柱是最常用的凈化提取方法。2009年由國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局及標(biāo)委會(huì)發(fā)布并實(shí)施的《食品中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的測(cè)定免疫親和層析凈化高效液相色譜法》（GB/T 23503-2009），將免疫親和層析柱作為凈化脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的標(biāo)準(zhǔn)方法[38]。

Li等[39]采用免疫親和柱和超高液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法確定谷類(lèi)食品中是否含有脫氧雪腐鐮刀菌烯醇。他采用抗DON單克隆抗體制備的免疫親和柱來(lái)凈化處理，然后用超高液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析谷物中的DON含量。這種免疫親和凈化方法對(duì)DON有較高的回收率。小麥、大米的回收率從61%～103%。柱容量是每毫升凝膠2.86μg DON，在間隔兩天10次循環(huán)使用后柱容量仍然可以高于0.68μg/m L DON。

4 存在問(wèn)題和現(xiàn)狀

真菌毒素檢測(cè)前處理最有效的方式是通過(guò)免疫親和吸附作用特異性地將毒素分子從待檢樣品的復(fù)雜組分中分離出來(lái)。但是還存在一些的問(wèn)題，主要表現(xiàn)在以下4方面：

4.1 價(jià)格高

我國(guó)用于食品真菌毒素檢測(cè)前預(yù)處理產(chǎn)品多依賴(lài)于進(jìn)口，每支柱的價(jià)格在150元左右。早在上世紀(jì)80年代，國(guó)外已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了真菌毒素免疫親和層析柱產(chǎn)業(yè)化，產(chǎn)品幾乎覆蓋了所有真菌毒素的檢測(cè)前處理，主要的品牌有德國(guó)的r-拜發(fā)、美國(guó)VICAM、美國(guó)becon。國(guó)內(nèi)真菌毒素特異性單克隆抗體的規(guī)模制備和抗體分子與層析介質(zhì)偶聯(lián)形成各式真菌毒素免疫親和層析產(chǎn)品是決定真菌毒素檢測(cè)前處理產(chǎn)品能否規(guī)?；a(chǎn)的決定因素。

4.2 抗體特異性

國(guó)際上，已實(shí)現(xiàn)真菌毒素特異性單克隆抗體的規(guī)模制備，但單克隆抗體對(duì)毒素分子的特異性還具有提升空間，而國(guó)內(nèi)多通過(guò)動(dòng)物直接免疫獲得的抗體產(chǎn)品，抗體產(chǎn)量低、特異性差、產(chǎn)品不穩(wěn)定。

4.3 重現(xiàn)性

國(guó)際國(guó)內(nèi)多采用直接偶聯(lián)的方式將抗體分子無(wú)序的固定在活化的層析介質(zhì)上，造成抗體親和介質(zhì)對(duì)毒素分子的吸附量低，抗體分子被低效利用，并造成一定程度的非特異性吸附，從而使批間產(chǎn)品之間存在較大的差異。

4.4 穩(wěn)定性

首先由于抗原與抗體的結(jié)合受溫度影響較大，其次試樣流過(guò)親和柱的流速直接影響抗體對(duì)毒素分子的捕獲，再有很多廠家很少公布自己產(chǎn)品的柱容量，導(dǎo)致客戶(hù)使用時(shí)，有時(shí)因上樣濃度大而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

5 展望

真菌毒素在谷物飼料中的污染已經(jīng)逐漸被人類(lèi)所重視，其檢測(cè)手段日漸趨于成熟。免疫親和柱前處理凈化技術(shù)在測(cè)定食品中真菌毒素含量方面起到不可替代的作用，大多數(shù)方法都是樣品提取后使用免疫親和柱凈化，基于HPLC的檢測(cè)。Ham ide Z Senyuvaa[40]曾報(bào)道該凈化方法已經(jīng)用于獸藥殘留，殺蟲(chóng)劑殘留、環(huán)境污染和維生素檢測(cè)方面。相信隨著免疫親和柱的不斷發(fā)展，其會(huì)運(yùn)用到更廣泛的領(lǐng)域。

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