高效液相色譜法測定玉米漿干粉中維生素B6的含量

劉躍芹，趙雪松，吳 杰，王金枝，吳延東，于立梅

（1.玉米深加工國家工程研究中心，吉林長春130033；2.仲愷農(nóng)業(yè)工程學院輕工與食品學院，廣東廣州510225）

玉米漿是玉米淀粉生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物，富含B族維生素[1-2]，玉米漿是生產(chǎn)抗生素、味精等發(fā)酵產(chǎn)品培養(yǎng)基的重要組成成分，由于其富含可溶性蛋白和多種游離氨基酸，是微生物發(fā)酵的良好氮源[3-5]。玉米漿干粉是由鮮玉米漿低溫瞬間加熱噴霧干燥而成，保持了玉米漿液的特性，而且便于儲存，使其應(yīng)用更加廣泛，在飼料行業(yè)以及抗生素、維生素、酶制劑等發(fā)酵工業(yè)中有重要應(yīng)用[6]。維生素B6又稱吡哆素，是一種含吡哆醇、吡哆醛或吡哆胺的B族維生素，其以輔酶形式參與體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝，具有重要的生理功能[7-9]。玉米漿中富含維生素B6，能夠?qū)τ衩诐{干粉中維生素B6的含量進行監(jiān)控，有利于玉米漿干粉的更廣泛應(yīng)用。當前各個與醫(yī)藥食品相關(guān)的行業(yè)對玉米漿干粉的關(guān)注程度提高，而目前對玉米漿干粉中維生素B6的檢測尚未見報道。

目前，國內(nèi)外已有關(guān)于測定飼料和藥品中維生素B6的報道，主要包括微生物法紫外分光光度法和高效液相色譜法，其中微生物法靈敏度高，但其對樣品的前處理復雜，實驗周期長，雜質(zhì)干擾大。紫外分光光度法的靈敏度較低、樣品的基質(zhì)干擾大等缺點，影響其廣泛應(yīng)用。高效液相色譜法因其分離效率高、選擇性好、靈敏度高、分析速度快和自動化程度強等優(yōu)點，逐漸成為維生素B6分析的首選方法。本文采用高效液相色譜法對玉米漿干粉中維生素B6進行了測定，建立了簡單、快速、準確的定量方法，對玉米漿干粉在生產(chǎn)中能夠更好地應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

維生素B6標準品 上海源葉生物科技有限公司，批號20120322；玉米漿干粉 法國羅蓋特公司產(chǎn)品；乙二胺四乙酸二鈉、鹽酸 均為分析純；庚烷磺酸鈉 優(yōu)級純；三乙胺和甲醇 色譜純；水 超純水。

2695型高效液相色譜儀、2414型可變波長型紫外檢測器 美國Waters公司；Milli-Q Gradient A10型超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準品溶液的配制 精密稱取適量維生素B6標準品于棕色容量瓶中，用0.1mol/L的鹽酸水溶液溶解至刻度，配成1mg/mL的儲備液。精密量取儲備液適量，用0.1mol/L的鹽酸水溶液稀釋至所需濃度，濃度分別為0.10、2.00、5.00、8.00、10.00、20.00、50.00、100.00μg/mL，避光保存于4℃冰箱。

1.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取5g玉米漿干粉于100mL棕色容量瓶，加入三分之二體積的鹽酸水溶液（0.1mol/L），超聲提取30min，中間旋搖一次，待溫度降低至室溫后，用鹽酸水溶液稀釋至刻度，過濾，取1.5mL清澈溶液過0.2μm濾膜，待測。整個操作過程需要注意避光，以避免維生素B6的光分解。

1.2.3 標準曲線的繪制 將標準系列溶液濃度為0.10、2.00、5.00、8.00、10.00、20.00、50.00、100.00μg/mL的維生素B6標準品進行HPLC析，記錄色譜圖；以待測物濃度為橫坐標，待測物的峰面積為縱坐標，用加權(quán)（W=1/x2）最小二乘法進行回歸運算[10]，求得的直線回歸方程，即為標準曲線。

1.2.4 準確度和精密度的考察 按1.2.1操作，分別制備低、中、高三個濃度（2.00、10.00、50.00μg/mL）的質(zhì)量控制（QC）樣品，每濃度6樣本，連續(xù)測定三天。根據(jù)當日的工作曲線，計算QC樣品的測得濃度，根據(jù)QC樣品結(jié)果計算本法的準確度與精密度。

1.2.5 提前回收率的考察 取玉米漿干粉樣品，分別加入低、中、高三個濃度的維生素B6標準品，制備濃度分別為2.00、10.00、50.00μg/mL的溶液，然后按1.2.2操作，每濃度四樣本；同時另取玉米漿干粉溶液，按1.2.2操作后，加入維生素B6標準溶液，配制成濃度為2.00、10.00、50.00μg/mL，渦旋混合，進行HPLC分析，獲得相應(yīng)峰面積，以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計算提取回收率，提取回收率=A1/A2×100。

1.2.6 樣品中維生素B6的測定 按1.2.2操作，制備三個平行樣品，每個分析批（一天內(nèi)測試的同種樣品）制備一條工作曲線，進行HPLC分析，根據(jù)峰面積進行定量計算。

1.2.7 色譜條件 色譜柱為Symmetry-C18柱（3.9mm×150mm，5μm）；流動相：A相為甲醇，B相為含0.05g/L EDTA和1.1g/L庚烷磺酸鈉的2.5%乙酸溶液（pH3.40），以A∶B為1∶6比例等度洗脫；流速為0.8mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為280nm；進樣體積為10μL；樣品分析時間為10min。

2 結(jié)果與分析

2.1 分析方法確證結(jié)果

2.1.1 標準曲線 測定維生素B6的典型標準曲線見圖1，其標準曲線方程為y=19509.8501x+2246.8396（r=0.9999），線性范圍為0.10～100.00μg/mL。

圖1 赤霞珠葡萄產(chǎn)地判別函數(shù)圖Fig.1 Plot of discriminant functions

2.1.2 準確度和精密度 維生素B6的準確度和精密度的測定結(jié)果見表1，日間和日內(nèi)精密度均小于15%，符合相關(guān)規(guī)范要求[8]。

表1 準確度與精密度實驗（n=6）Table 1 Accuracy and precision of the measured results

2.1.3 提取回收率 維生素B6的低、中、高三個濃度回收率結(jié)果參見表2。三種濃度下玉米漿干粉樣品中維生素B6的提取回收率分別平均為93.66%±1.38%、95.60%±2.77%、93.52%±2.46%。

表2 提取回收率實驗（n=4）Table 2 Recoveries of the measured results（n=4）

2.2 樣品測定結(jié)果

維生素B6標準品色譜圖和樣品色譜圖見圖2，測得玉米漿干粉中維生素B6的含量見表3，玉米漿干粉中維生素B6的平均含量為40.91mg/kg。

3 討論

采用紫外-可見分光光度法對玉米漿干粉樣品進行測定，由于雜質(zhì)干擾嚴重，無法準確測定，而高效液相色譜法可以將樣品中維生素B6的色譜峰與其他基質(zhì)峰進行有效分離，且峰形良好，可以對玉米漿干粉中維生素B6進行精確定量。維生素B6色譜峰的保留時間為4.0min，維生素B6可在10min內(nèi)與其他雜質(zhì)峰分離，本法可以達到快速檢測的目的。玉米漿干粉樣品前處理簡單，維生素B6是水溶性維生素，在酸液中穩(wěn)定，本法采用0.1mol/L的鹽酸水溶液進行提取，前處理操作步驟少，經(jīng)濟快速，穩(wěn)定可靠，適用于維生素B6的快速測定。

圖2 維生素B6的標準品和樣品的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of vitamin B6 standard and sample

表3 玉米漿干粉中維生素B6的測定結(jié)果（n=3）Table 3 Recoveries of the measured results（n=3）

4 結(jié)論

本實驗建立了高效液相色譜法測定玉米漿干粉中維生素B6的檢測方法。確定了色譜條件：色譜柱為Symmetry-C18柱（3.9mm×150mm，5μm）；流動相：A相為甲醇，B相為含0.05g/L EDTA和1.1g/L庚烷磺酸鈉的2.5%乙酸溶液（pH3.40），以A∶B為1∶6比例等度洗脫；流速為0.8mL/min；柱溫為30℃；檢測波長為280nm；進樣體積為10μL；樣品分析時間為10min。結(jié)果顯示，維生素B6的線性范圍為0.10～100.00μg/mL（r=0.9999），日間和日內(nèi)精密度均小于15%，回收率較好。此法操作簡便、快速、準確，可作為玉米漿干粉中維生素B6含量的檢測方法，為玉米漿干粉的質(zhì)量控制提供了可靠的分析檢測方法。

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