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    柑橘果實(shí)中主要的真菌毒素及其檢測(cè)技術(shù)

    2013-08-15 00:51:54胡媛媛張宇昊
    食品工業(yè)科技 2013年24期
    關(guān)鍵詞:鏈格柑橘毒素

    胡媛媛,馬 良,2,*,張宇昊,3

    (1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院,重慶400715;2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(重慶),重慶400716;3.重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心,重慶400716)

    柑橘是世界產(chǎn)量最大的水果,也是我國(guó)主要種植水果之一。柑橘在生長(zhǎng)、采收、貯藏、運(yùn)輸、銷售等各個(gè)過(guò)程,易受到病原微生物污染,產(chǎn)生并積累各種生物毒素。目前柑橘常見(jiàn)病害有青綠霉病,黑腐病,酸腐病,蒂腐病,炭疽病等。受柑橘生長(zhǎng)條件的不同以及外界因素影響,病害主要發(fā)生在果實(shí)采收期和/或貯藏期,造成柑橘的大量腐爛,并產(chǎn)生代謝毒素,其中最主要的真菌毒素包括展青霉素(patulin,PAT),橘青霉素(citrinin,CIT),鏈格孢霉毒素(Alternaria mycotoxins)。目前,針對(duì)水果真菌毒素的研究主要集中在蘋果及其產(chǎn)品中展青霉素和赭曲霉毒素(ochratoxin,OT)的研究,柑橘類水果中真菌毒素的研究很少,尤其是對(duì)CIT,鏈格孢霉素等的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)、限量標(biāo)準(zhǔn)以及柑橘類水果中真菌毒素產(chǎn)生、污染和分布等方面均缺乏基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和系統(tǒng)研究。因此對(duì)柑橘中主要真菌毒素檢測(cè)、分布、污染控制等技術(shù)的研究,對(duì)柑橘及其產(chǎn)品的質(zhì)量安全具有極其重要的意義。

    1 影響柑橘質(zhì)量安全的主要真菌毒素

    柑橘采后貯藏階段是病害污染和毒素產(chǎn)生的主要階段。貯藏期的病害可分為貯藏期侵染病害和采前侵染病害。貯藏期侵染病害包括青霉病、綠霉病等,采前侵染病害包括柑橘黑腐病、柑橘褐腐病、黑色蒂腐病、炭疽病等,其中青綠霉病和柑橘黑腐病是產(chǎn)真菌毒素的主要病害[1]。意大利青霉和指狀青霉是引發(fā)柑橘青、綠霉病的主要霉菌,它們的最適生長(zhǎng)溫度在25℃左右,最適水分活度為0.95,因此只要溫濕適宜,就會(huì)引發(fā)柑橘的腐爛并產(chǎn)生大量真菌毒素,如展青霉素、橘青霉素、青霉酸等。柑橘黑腐病是由鏈格孢霉引起的,它的最低耐受溫度可達(dá)-5℃左右,在采收前以菌絲體或分生孢子的形式吸附在果實(shí)表面,當(dāng)溫度適宜時(shí)從果實(shí)傷口或果蒂處侵入致病,產(chǎn)生大量鏈格孢霉素[2]。

    青綠霉病從果實(shí)表面開(kāi)始侵染柑橘,并存在交叉侵染的情況,在柑橘病害中具有高發(fā)性,柑橘黑腐病則主要是從果蒂處開(kāi)始侵染,由內(nèi)部開(kāi)始破壞果實(shí)組織,具有隱藏性。因此它們是影響柑橘質(zhì)量安全的主要病害,而它們所產(chǎn)生的真菌毒素應(yīng)成為控制柑橘類產(chǎn)品質(zhì)量安全的重點(diǎn)監(jiān)控對(duì)象。

    1.1 展青霉素

    展青霉素(patulin,PAT)又名棒曲霉素,由曲霉菌、青霉菌和絲衣霉產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物,是水果中常見(jiàn)真菌毒素。PAT是一種低分子量的半縮醛內(nèi)酯,在柑橘中主要由指狀青霉和意大利青霉產(chǎn)生,在兩種霉菌受到抑制時(shí),也可由烏來(lái)青霉產(chǎn)生[3]。青霉菌屬的孢子利用柑橘傷口處的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)萌發(fā)形成菌絲,能夠快速繁殖并產(chǎn)生毒素,溶解傷口附近的白皮層,再溶解黃皮層,完成對(duì)果實(shí)組織細(xì)胞的降解[4]。實(shí)驗(yàn)證明甜橙、克萊門柚、溫州蜜柑中的黃烷酮橘皮苷,葡萄柚中的柚苷,以及檸檬中的黃烷酮橘皮苷和黃烷酮葉香木甙含量都會(huì)影響柑橘對(duì)青霉菌的敏感度,特別是甜橙、溫州蜜柑中含高濃度的多甲基黃酮,被認(rèn)為是對(duì)青霉菌最不敏感品種,因此展青霉素污染較少[5]。一般情況下PAT存在于青綠霉菌引發(fā)的腐爛部位處,且腐爛程度越大,PAT的濃度越高[5]。有研究發(fā)現(xiàn),PAT在水果中擴(kuò)散可能滲透到腐爛部位周圍幾厘米處,擴(kuò)散速度與水果的種類、腐爛面積、成熟程度、含水率、糖酸比等因素有關(guān),質(zhì)地越松軟,糖酸比越高,PAT的擴(kuò)散速度越快,水果品種不同,也會(huì)影響PAT的擴(kuò)散速度[6-7]。

    PAT經(jīng)不同途徑接觸動(dòng)物,LD50為15~25mg/kg,具有急性毒性,包括對(duì)動(dòng)物的肺、腦水腫、肝臟、脾臟、腎的損害和免疫系統(tǒng)的毒害作用;也具有慢性毒性,表現(xiàn)在對(duì)動(dòng)物的細(xì)胞毒性,基因毒性和免疫毒性。對(duì)巰基有強(qiáng)親和力,可與含巰基的蛋白和多肽反應(yīng),破壞DNA單鏈和雙鏈,從而抑制DNA和RNA的合成,也可抑制多種酶活性,特別是一些生化指標(biāo)中的酶,如堿性磷酸酶、二磷酸果糖酶和己糖激酶等。在相當(dāng)大劑量范圍內(nèi),可使小鼠大腦、腎臟、肝臟中DNA鏈破裂,其中大腦是最主要的靶器官[8]。此外,對(duì)成年哺乳動(dòng)物和胚胎期動(dòng)物的腎臟也有毒害作用[9]。直接接觸皮膚,可引起DNA損傷,從而造成細(xì)胞周期阻滯和內(nèi)部介導(dǎo)細(xì)胞凋亡,積累大量具有皮膚毒性的聚胺產(chǎn)物[10]。

    鑒于PAT的遺傳毒性和免疫毒性等危害,世界各國(guó)對(duì)PAT在水果中的限量標(biāo)準(zhǔn)大多規(guī)定在50μg/kg以內(nèi),主要以蘋果和山楂作為主要限制對(duì)象,WHO規(guī)定在蘋果汁中PAT的限量值為50μg/kg,歐盟關(guān)于PAT最新規(guī)定中蘋果泥中最大允許限量為25μg/kg,特別指出嬰兒食品中最大限量不超過(guò)10μg/kg,我國(guó)規(guī)定在蘋果和山楂制品中限量值為50μg/kg。目前,國(guó)內(nèi)外對(duì)柑橘屬中PAT的限量標(biāo)準(zhǔn)屬于空白,亟待針對(duì)不同柑橘種類、不同食用方式等進(jìn)行相關(guān)PAT限量標(biāo)準(zhǔn)的研究和完善。

    1.2 橘青霉素

    橘青霉素(citrinin,CIT)是一類醌甲基化合物,由橘青霉、土曲霉、擴(kuò)展青霉、純綠青霉和一些紅曲霉屬產(chǎn)生。柑橘果實(shí)常常遭到橘青霉、土曲霉、擴(kuò)展青霉、意大利青霉污染而產(chǎn)生CIT。它是一種酸性的淡黃色晶體,在250nm和330nm處有最大紫外吸收,熔點(diǎn)為172℃。CIT有強(qiáng)抑菌效果,可作為抗生素使用[11]。但它對(duì)動(dòng)物和人類具有腎毒性、基因毒性、致癌性、胚胎毒性,它是一種腎毒素,會(huì)破壞動(dòng)物腎小管,毒害胚胎期動(dòng)物的腎臟,是巴爾干腎病的潛在的病原體[9]。它還會(huì)對(duì)小鼠生殖器官有一定的損害[12]。其胚胎毒性,主要體現(xiàn)在加快了細(xì)胞凋亡,使胎兒體重減少,用CIT處理過(guò)的胚囊的移植成功率大大降低[13]。此外,CIT能與其他毒素發(fā)生協(xié)同作用,它和赭曲霉素都是作為具有腎毒性的致癌物質(zhì),在同時(shí)存在時(shí)可極大增強(qiáng)基因毒性,加速DNA鏈的斷裂和抑制細(xì)胞增殖[14]。

    CIT在世界上沒(méi)有統(tǒng)一的限量標(biāo)準(zhǔn),主要原因是沒(méi)有合適的常規(guī)分析方法。另外,加工過(guò)程中不同的加工技術(shù)會(huì)對(duì)CIT及其含量造成影響,也造成了CIT限量標(biāo)準(zhǔn)制定具有相當(dāng)?shù)睦щy。如,加工過(guò)程中可利用CIT的螯合能力和對(duì)pH和溫度敏感性,進(jìn)行食物中CIT的有效脫除[15]。但鮮果仍是柑橘果品最重要的食用方式之一,CIT具有的毒性及其對(duì)柑橘鮮果廣泛的污染一直以來(lái)嚴(yán)重威脅著柑橘的消費(fèi)安全。

    1.3 鏈格孢霉素

    鏈格孢霉素是由鏈格孢霉產(chǎn)生的一系列代謝產(chǎn)物,主要包括細(xì)交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid,TeA)、鏈格孢酚(alternariol,AOH)、鏈格孢酚甲基醚(alternariolmethyl ether,AME)、細(xì)格菌毒素、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(altertoxinⅠ、Ⅱ、Ⅲ,ATX-Ⅰ、ATX-Ⅱ、ATX-Ⅲ)和AAL毒素(AAL-toxin)。其中TeA、AOH、AME均在柑橘類水果中檢出,是污染柑橘的主要鏈格孢霉素[16]。不同品種的柑橘,對(duì)柑橘鏈格孢的敏感性也有所差異,以丹西紅桔和王柑為親本的雜交產(chǎn)物、葡萄柚、克里曼朋橘、皇帝柑極易感染柑橘鏈格孢霉,溫州蜜橘和橙類品種(西班牙橙除外)表現(xiàn)出輕微的敏感性,檸檬和酸橙類品種(墨西哥酸橙輕微敏感)不易感染鏈格孢霉菌[17]。

    鏈格孢菌在不同柑橘中的主要侵染方式不同,造成鏈格孢霉毒素在不同品種中分布情況不同。有研究報(bào)道,甜橙、檸檬類柑橘以蒂部侵入為主,而溫州蜜柑類寬皮柑橘,以果皮侵染為主[18]。因此甜橙、檸檬類柑橘果實(shí)內(nèi)部的鏈格孢霉素含量可能比外部高,溫州蜜柑類寬皮柑橘果實(shí)外部毒素含量可能高于內(nèi)部。類似鏈格孢霉的污染造成果實(shí)表面特征不能反映果實(shí)的實(shí)際質(zhì)量,增加了柑橘鮮果、果皮類產(chǎn)品等安全風(fēng)險(xiǎn)。雖然柑橘鮮果含有果皮、白皮層、果肉,可有效隔絕病原微生物及其毒素對(duì)果肉的侵害和污染,但柑橘組織損傷時(shí),這些污染是無(wú)法避免的[19]。Stinson等[20]在橙子和檸檬中發(fā)現(xiàn)了TeA、AOH和AME,其中TeA濃度分別為61.1和48.8μg/g,AOH和AME在柑橘中濃度分別為41、2.8μg/g,且橙子中毒素含量普遍高于檸檬。

    TeA屬于四氨基酸衍生物,具有抗菌活性,是一種水溶性鏈格孢霉素,雄性小鼠經(jīng)口LD50=182mg/kg,雌性小鼠經(jīng)口LD50=81mg/kg,被認(rèn)為是所有鏈格孢霉代謝產(chǎn)物中毒性最強(qiáng)的毒素[21]。它可以抑制蛋白合成,抑制皮膚腫瘤惡化[22]。它也是一種天然植物毒素,表現(xiàn)在干擾光合系統(tǒng)Ⅱ中酶電子的接受傳遞,從而抑制光合系統(tǒng)Ⅱ的活性[23]。AOH和AME屬于苯并吡喃酮衍生物,具有遺傳毒性,單一TeA在200μmol/L下對(duì)DNA無(wú)明顯破壞作用,但三種毒素混合具有協(xié)同作用,對(duì)DNA的破壞作用遠(yuǎn)超過(guò)單一組分效果之和[21]。也有報(bào)道AOH、AME、TeA在鏈格孢霉素致突變作用中,只起到小部分作用,并不是主要致突變成分[24]。Fatma等[25]利用人體結(jié)腸癌細(xì)胞,研究了AOH的細(xì)胞毒性,發(fā)現(xiàn)AOH通過(guò)激活細(xì)胞中線粒體造成細(xì)胞凋亡從而降低細(xì)胞活性。

    越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)和報(bào)道證實(shí)鏈格孢霉素在柑橘污染中具普遍性,且對(duì)哺乳動(dòng)物具有較強(qiáng)的遺傳危害。但是目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)各種鏈格孢霉素限量的相關(guān)法律法規(guī),需要對(duì)相關(guān)領(lǐng)域進(jìn)行研究。

    2 水果檢測(cè)的主要真菌毒素

    水果中真菌毒素檢測(cè)普遍使用的方法有薄層色譜法、高效液相色譜法、氣相色譜法、免疫學(xué)方法等,液相色譜法是應(yīng)用最廣泛的方法,也是我國(guó)果品中真菌毒素檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法之一。由于TLC檢測(cè)靈敏度低,且在羥甲基糠醛存在時(shí)對(duì)真菌毒素的分離效果差,因此只能用于定性或半定量分析。液相色譜應(yīng)用后,TLC逐步淡出水果檢測(cè)領(lǐng)域,目前已極少應(yīng)用在水果中真菌毒素檢測(cè)。與此同時(shí),一些新的檢測(cè)手段也開(kāi)始應(yīng)用于水果的毒素檢測(cè),如高效毛細(xì)管電泳法,近紅外檢測(cè)技術(shù)等。

    目前這些檢測(cè)技術(shù)主要用于蘋果、梨、橄欖等水果中真菌毒素的檢測(cè),而針對(duì)柑橘中真菌毒素檢測(cè)技術(shù)的系統(tǒng)研究屬于空白。柑橘本身含有黃酮類化合物,故其果汁大多為黃色,在進(jìn)行檢測(cè)時(shí),尤其是進(jìn)行色譜檢測(cè)時(shí),容易造成干擾,影響分析結(jié)果。因此,綜合各種水果中真菌毒素檢測(cè)技術(shù)的研究進(jìn)展,與柑橘果實(shí)本身的基質(zhì)特性以及柑橘產(chǎn)業(yè)相結(jié)合,對(duì)今后柑橘產(chǎn)業(yè)鏈中真菌毒素的檢測(cè)技術(shù)的研究以及真菌毒素的監(jiān)控具有極其重大的意義。

    2.1 色譜技術(shù)

    2.1.1 液相色譜技術(shù)(liquid chromatography,LC) 影響液相檢測(cè)結(jié)果的主要是樣品前處理方式和檢測(cè)器類型,利用液相色譜法檢測(cè)水果真菌毒素常用檢測(cè)器是熒光檢測(cè)器和紫外檢測(cè)器,不同檢測(cè)器對(duì)不同毒素的靈敏度不同。研究發(fā)現(xiàn),熒光檢測(cè)CIT結(jié)果的靈敏度是紫外檢測(cè)結(jié)果的100倍[26],而在鏈格孢霉素檢測(cè)時(shí),從檢出限到回收率,紫外檢測(cè)的結(jié)果均優(yōu)于熒光檢測(cè)[27]。Scott等[28]將蔓越橘汁過(guò)固相萃取柱,利用反相LC-UV檢測(cè)果汁中的鏈格孢霉素,AOH和AME的檢出限均在0.4μg/L,回收率分別為93%和81%。陳月萌等[29]建立了同時(shí)檢測(cè)水果中三種鏈格孢霉素的高效液相色譜-熒光分析方法,利用固相萃取作為樣品前處理手段,成功檢測(cè)出水果中殘留鏈格孢霉素,回收率均在78.2%~103.6%范圍內(nèi)。Li等[30]用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(evaporative light-scattering detector,ELDS)代替了傳統(tǒng)的紫外檢測(cè)器,與液相色譜儀結(jié)合,用于檢測(cè)鏈格孢霉素,線性響應(yīng)范圍在0.4~4μg之間,檢出限在6μg/m L,與經(jīng)衍生處理后HPLC檢測(cè)方法相比,HPLC-ELDS方法的靈敏度更高。液相色譜分析前,一般需要對(duì)待檢物質(zhì)進(jìn)行分離純化濃縮等前處理,有的真菌毒素還需要衍生處理,以提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。選擇不同的萃取方式也會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度,常見(jiàn)前處理方法包括液液萃取、傳統(tǒng)固相萃取、免疫親和柱富集等,它們各有其優(yōu)勢(shì)與不足。果汁中的PAT經(jīng)固相萃取后,其濃度是液液萃取效果的十倍左右,大大增強(qiáng)了檢測(cè)靈敏度[31]。同時(shí),不同萃取方法適用的產(chǎn)品不同,基質(zhì)分散固相萃取適用于對(duì)濃縮果汁PAT監(jiān)控,而固相萃取更適用于稀釋果汁的分析。Tokusoglu等[32]利用免疫親和柱-高效液相色譜-熒光檢測(cè)器同時(shí)檢測(cè)水果中的CIT和OT,平均回收率均在90%以上,檢出限均為0.05μg/kg,可用于水果及制品的快速檢測(cè)。近年來(lái),水果毒素分析中開(kāi)始引入分子印跡技術(shù),結(jié)合固相萃取,建立了一種改良的前處理方法,即分子印跡-固相萃?。╩olecularly imprinted solid phase extraction,MISPE)。它是一種基于固相萃取原理的新型萃取技術(shù),分子印跡聚合物通過(guò)嫁接的聚合方法,吸附在二氧化硅珠上,用于PAT的提取,最大可吸附93.97%的PAT,且回收率超過(guò)90%,是一種良好的新型萃取方法[33]。Guo等[34]以1-羥基-2-萘酸為模板制備CIT分子印跡聚合物,結(jié)合液相色譜檢測(cè)CIT,結(jié)果表明這種聚合物可以高選擇性吸附CIT,回收率為86.7%~97.7%。

    2.1.2 液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)(liquid chromatographymass spectrometry,LC-MS) 盡管液相色譜技術(shù)能夠良好檢測(cè)水果中的鏈格孢霉素,液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)合檢測(cè),不僅可以避免衍生,縮短分析時(shí)間,還能提高對(duì)毒素的分辨率。當(dāng)前檢測(cè)果汁PAT時(shí),多采用固相萃取、HPLC和MS結(jié)合,回收率可達(dá)90%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD在1.5%~7.5%之間,檢測(cè)靈敏度高[35]。Song等[36]將固相萃取與HPLC及MS相結(jié)合進(jìn)行果汁中PAT、OTA、AFB1含量檢測(cè),定量限最低達(dá)0.8μg/kg,回收率在66%~127%范圍內(nèi)。Rodrigo等[37]采用HPLCMS對(duì)金桔的外果皮和中果皮(白色組織)中的AOH、AME進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果表現(xiàn)出良好線性范圍0.5~20.0mg/kg,相關(guān)性為0.997,檢測(cè)限和定量限分別小于0.13、0.5μg/kg。由于TeA是一種強(qiáng)酸,可以與金屬發(fā)生螯合,特別是在分析含多種干擾物的基質(zhì)時(shí),極易影響儀器分析的準(zhǔn)確性。

    雖然LC-MS相較于LC提高了檢測(cè)靈敏度,但是TeA類物質(zhì)衍生時(shí)仍然存在這類問(wèn)題,因此同位素薄弱化分析(stable isotope dilution assay,SIDA)作為一種優(yōu)化手段,用于水果中真菌毒素檢測(cè)。它主要是通過(guò)合成一種穩(wěn)定的同位素標(biāo)記物,作為待檢物質(zhì)內(nèi)標(biāo)物,以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度。Stefan等[38]將同位素薄弱分析方法用于檢測(cè)TeA,首先合成穩(wěn)定的同位素標(biāo)記物[13C6,15N]-TeA作為對(duì)應(yīng)毒素的內(nèi)標(biāo)物,進(jìn)行LCMS掃描,紫外檢測(cè)器檢測(cè),實(shí)驗(yàn)表明,該方法即彌補(bǔ)衍生反應(yīng)的不完整性,還能簡(jiǎn)化操作,增加檢測(cè)結(jié)果的可靠性。有研究表明SIDA引入水果毒素分析,再結(jié)合LC-MS檢測(cè)水果中的PAT含量回收率高達(dá)94%~104%,符合歐盟檢測(cè)最高要求水平[39]。

    此外,大氣壓化學(xué)電離(atmospheric pressure chem ical ionization,APCI)也被引入LC-MS檢測(cè)中,可用于檢測(cè)五種鏈格孢霉素在果蔬汁產(chǎn)品中的含量,僅需簡(jiǎn)單萃取處理樣品,大大節(jié)省了檢測(cè)時(shí)間,是一種新型檢測(cè)方法[40]。

    2.1.3 氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS) 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)同樣可以用于檢測(cè)水果中PAT,該方法減少了濃縮和凈化的步驟,有效縮短了前處理時(shí)間,但檢出限偏高,雖然GC-MS對(duì)PAT有良好分辨率,可在分析中方便識(shí)別目標(biāo)物,但精密度、重復(fù)性、檢出限和成本等因素綜合比較,HPLC-DAD更適用于日常分析研究[41]。在采用GC-MS方法檢測(cè)PAT時(shí),需選擇一定內(nèi)標(biāo)物,如Cunha等以13C5-7PAT為內(nèi)標(biāo)物檢測(cè)橙汁中的PAT,Xiao等以3-硝基苯甲醇為內(nèi)標(biāo)檢測(cè)果汁中PAT,這樣可以彌補(bǔ)目標(biāo)分析物的損失,抑制樣品基質(zhì)影響[42-43]。

    2.2 免疫速測(cè)方法

    與液相色譜不同,免疫分析法不需要考慮凈化、富集、衍生等問(wèn)題,也無(wú)需考慮鏈格孢霉素?zé)晒庵档娜狈Γ粡V泛用于檢測(cè)展青霉素和鏈格孢霉素。同時(shí),它也是檢測(cè)水果中CIT的主要方法,雖然液相色譜也適用于CIT的檢測(cè),但是目前大多用于谷物、動(dòng)物飼料等原料的CIT檢測(cè),而在水果中的應(yīng)用較少。

    目前,免疫速測(cè)方法檢測(cè)水果真菌毒素,使用最多的是酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA),也可使用熒光免疫分析、膠體金免疫技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)等。De Champdore等[44]建立了一種新型競(jìng)爭(zhēng)性熒光偏振免疫檢測(cè)方法檢測(cè)PAT,這種分析方法是基于在PAT固定化衍生物和樣品PAT之間建立一種競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合熒光標(biāo)記抗體的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。通過(guò)檢測(cè)PAT與熒光標(biāo)記抗體結(jié)合過(guò)程中熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光值,判定樣品中PAT含量,檢出限為10μg/L,適用于PAT的微量檢測(cè)。Yvonne[45]和Madeleine等[46]制備出AOH、TeA的單克隆抗體和多克隆抗體,利用直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)水果及其飲料中的AOH、TeA,其中AOH的檢測(cè)限可達(dá)1~2μg/kg,而TeA在水果中的檢測(cè)范圍達(dá)25~150μg/kg。

    一些基于特異性抗體的快速檢測(cè)設(shè)備同樣被用于水果中PAT、CIT和鏈格孢霉素的檢測(cè),它們不僅可作為HPLC的前處理方法,如免疫親和柱-液相色譜的應(yīng)用,也有一些可直接用于檢測(cè),如ELISA試劑盒、生物傳感器等。Qian等[47]將CIT抗體固定在改良固定相電極表面開(kāi)發(fā)出一種新型電壓免疫感應(yīng)器,測(cè)定CIT含量,分析結(jié)果無(wú)明顯交叉反應(yīng),線性范圍介于25~100μg/m L。此外,微流體免疫傳感器也可用于檢測(cè)CIT,它是利用特異競(jìng)爭(zhēng)免疫分析方法,引發(fā)氧化還原反應(yīng),產(chǎn)生電流,根據(jù)電流的強(qiáng)弱判斷待測(cè)物中CIT的數(shù)量。這種微流體免疫傳感器的適用范圍在0.5~50ng/m L,且整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅需45m in,與目前其他分析方法,特別是色譜分析相比,具有耗時(shí)短、選擇性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)[48]。

    雖然免疫速測(cè)方法具備靈敏度高、耗時(shí)短、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),但真菌毒素的單克隆抗體制備過(guò)程較復(fù)雜,成本較高,且檢測(cè)對(duì)象單一,不利于免疫方法的普及。因此,研究出一種可同時(shí)檢測(cè)污染并可對(duì)水果主要真菌毒素的速測(cè)方法是今后研究的熱點(diǎn)之一。

    2.3 高效毛細(xì)管電泳技術(shù)(high performance capillary electrophoresis,HPCE)

    高效毛細(xì)管電泳是集電泳和色譜為一體的新型液相分離技術(shù),其分析速度快、靈敏度高、進(jìn)樣量少、再現(xiàn)性佳、能直接進(jìn)樣,易于自動(dòng)化操作,作為一種重要的分離分析方法被廣泛應(yīng)用。

    目前,膠束毛細(xì)管電泳法(micellar electrokinetic capillary chromatography,MEKC或MECC)已經(jīng)成功用于果汁中PAT檢測(cè),且從回收率、精密度、檢出限等方面均優(yōu)于HPLC方法[49-50]。有研究中也提到優(yōu)化后的微乳液毛細(xì)管電動(dòng)色譜(microemulsion electrokinetic chromatography,MEEKC)和毛細(xì)管區(qū)帶電泳也可用于果汁PAT的檢測(cè),到達(dá)理想的分離效果[51-52]。因此,HPCE技術(shù)在各種柑橘鮮果及制品PAT及各種毒素檢測(cè)中,將發(fā)揮越來(lái)越重要的作用。

    2.4 無(wú)損光譜檢測(cè)技術(shù)

    非侵入無(wú)損光譜檢測(cè)技術(shù)包括穩(wěn)態(tài)和時(shí)間分辨熒光光譜,紫外/可見(jiàn)/近紅外光譜,雙光子誘導(dǎo)熒光光譜。它已被用于谷物及其制品中真菌及其毒素檢測(cè),但在柑橘等水果中還處于檢測(cè)其內(nèi)部品質(zhì)的階段。其中紫外、熒光檢測(cè)器常與HPLC聯(lián)用,近紅外光譜技術(shù)開(kāi)始用于水果及其制品的PAT的研究,而雙光子誘導(dǎo)熒光光譜,由于在雙光子激發(fā)條件下可顯著降低基質(zhì)成分的背景輻射干擾,可用于葡萄酒和啤酒真菌毒素的定性定量檢測(cè)[53]。

    近年來(lái),近紅外光譜檢測(cè)食品真菌毒素的研究多用于谷物、飼料等食品中,它區(qū)別與以往的化學(xué)檢測(cè),作用對(duì)象是檢測(cè)樣品本身,無(wú)需進(jìn)行處理,既能節(jié)省時(shí)間,又能降低成本,但是在水果領(lǐng)域中的應(yīng)用有待提高[54-55]。張亮[56]采用傅立葉近紅外光譜法分析PAT,并建立了近紅外光譜分析法檢測(cè)不同體系中PAT的檢測(cè)模型,在濃縮蘋果汁中PAT平均回收率達(dá)99.97%,具有高精密度和準(zhǔn)確度,可用于濃縮果汁的快速檢測(cè)。值得注意的是,一方面,光譜法是通過(guò)光的反射或透射來(lái)檢測(cè)的,因而其對(duì)表面污染的區(qū)分效果比深層污染更好;另一方面,由于水果的成分復(fù)雜,某些物質(zhì)的吸收峰可能會(huì)覆蓋毒素的部分特征吸收峰,只能通過(guò)加大樣品量來(lái)增加模型穩(wěn)定性。因此,近紅外光譜技術(shù)檢測(cè)水果中真菌毒素還需要進(jìn)一步研究。

    2.5 PCR技術(shù)

    目前有報(bào)道采用各種分子生物學(xué)技術(shù)也可進(jìn)行真菌毒素的快速鑒定。主要是通過(guò)PCR技術(shù)識(shí)別真菌毒素產(chǎn)生菌DNA片段,從而判斷該水果是否可能含有該真菌產(chǎn)生的毒素[57]。M iguel等[58]利用鏈格孢霉與其產(chǎn)生毒素含量正相關(guān)的關(guān)系,通過(guò)采用基于序列遺傳標(biāo)記的PCR技術(shù)識(shí)別水果中鏈格孢霉的DNA,從而判斷水果是否被鏈格孢霉素污染。也有研究通過(guò)檢測(cè)PAT、OTA的復(fù)合PCR片段檢測(cè)PAT、OTA產(chǎn)生菌的DNA,判定食物中致病菌污染情況[59-60]。但是,這種技術(shù)同樣存在缺陷,如未經(jīng)過(guò)前處理的PCR檢測(cè),因其不能有效區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞,可能過(guò)高估計(jì)產(chǎn)毒菌的含量,從而影響對(duì)毒素污染食品的檢測(cè)結(jié)果。為此,Ana等[61]研究出一種新型的核酸染色插層法作為一種前處理手段,用以克服這類問(wèn)題,但是該前處理中用到的DNA結(jié)合染料對(duì)細(xì)胞也可能造成一定的損害,因此選擇適當(dāng)?shù)那疤幚矸椒ê驮噭┮彩悄壳癙CR技術(shù)應(yīng)用于水果中真菌毒素檢測(cè)的難點(diǎn)之一。

    3 展望與討論

    目前國(guó)內(nèi)外缺乏統(tǒng)一的針對(duì)柑橘類鮮果及食品中毒素的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn),也沒(méi)有針對(duì)可能污染柑橘毒素的限量標(biāo)準(zhǔn)。相關(guān)柑橘的研究主要集中在病害機(jī)理、病蟲(chóng)害防治、貯藏保鮮等方面,缺乏針對(duì)侵染后柑橘中真菌毒素的產(chǎn)生、污染分布和控制等的系統(tǒng)性研究。

    在病蟲(chóng)害防治研究中化學(xué)防治仍然是目前使用最廣泛的方法,其中殺菌劑對(duì)真菌毒素的影響,并沒(méi)有引起普遍關(guān)注。近年來(lái),一些殺菌劑被報(bào)道和證明不僅不會(huì)抑制真菌毒素的生長(zhǎng),還會(huì)刺激其含量的升高[62]。殺菌劑與真菌毒素的互作關(guān)系及機(jī)理不明,使用殺菌劑無(wú)法保證柑橘類食品的食用安全性。因此,了解真菌毒素在柑橘中的產(chǎn)生、污染、分布情況,對(duì)有效控制柑橘水果安全有重要意義。

    目前柑橘真菌毒素污染控制主要存在以下三點(diǎn)問(wèn)題:

    工業(yè)生產(chǎn)橙汁,檸檬汁等果汁生產(chǎn)過(guò)程中主要是通過(guò)剔除腐爛部分降低毒素及病菌污染的風(fēng)險(xiǎn),但是這并不能完全消除風(fēng)險(xiǎn)。有的病原菌,如鏈格孢菌屬可使柑橘果實(shí)內(nèi)部腐爛而表皮無(wú)明顯變化,不能通過(guò)沖洗,分揀操作去除毒素,增加了果汁類產(chǎn)品的安全隱患。

    柑橘中真菌毒素主要集中在果皮,由于柑橘屬水果以鮮果果肉或果汁為傳統(tǒng)食用方式,果皮棄去或用于制藥、陳皮、飼料等,因此過(guò)去柑橘真菌毒素污染風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較低。但是隨著柑橘果肉和果皮應(yīng)用范圍的擴(kuò)大,極大增加了毒素污染風(fēng)險(xiǎn)和人類中毒的幾率。近年來(lái),柑橘皮渣的回收利用成為柑橘加工和副產(chǎn)品綜合利用的一大重點(diǎn),特別是作為新型動(dòng)物飼料應(yīng)用廣泛。此外還有柑橘粉、柑橘酒、柑橘糖漿等副產(chǎn)物的研發(fā),極大的擴(kuò)展了柑橘類果皮的使用范圍,而柑橘皮是真菌毒素污染的首要部分,這些產(chǎn)品極大增加了毒素污染柑橘食品和通過(guò)污染飼料繼而污染畜禽等動(dòng)物源性食品的風(fēng)險(xiǎn),間接威脅人類飲食安全。

    目前,國(guó)內(nèi)外尚無(wú)針對(duì)柑橘類水果真菌毒素污染的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)及限量標(biāo)準(zhǔn),難以實(shí)現(xiàn)對(duì)農(nóng)產(chǎn)品以及工業(yè)化生產(chǎn)的安全監(jiān)控。

    總之,在柑橘產(chǎn)業(yè)鏈中真菌毒素的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和污染控制研究處于空白階段的情況下,需要結(jié)合國(guó)內(nèi)外對(duì)水果真菌毒素的研究,對(duì)柑橘真菌毒素污染分布、快速檢測(cè)及其控制技術(shù)進(jìn)行確定和改良,這也是提高柑橘產(chǎn)品競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的必要條件,研究如何在柑橘制品生產(chǎn)過(guò)程中去除污染的真菌毒素以及如何高效快速檢測(cè)相關(guān)產(chǎn)品的污染水平將成為研究重點(diǎn)。

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