黑加侖花色苷抗禽白血病A亞群病毒作用

雷用東， 王 丹， 童軍茂， 張 莉， 馬 越， 張 超， 趙曉燕*

（1.北京市農(nóng)林科學(xué)院 蔬菜研究中心，北京 100097；2.石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子 832003）

黑加侖（Blackcurrant），拉丁名 Ribes nigrum L.，學(xué)名黑穗醋栗，在我國(guó)東部地區(qū)廣泛種植[1]。研究發(fā)現(xiàn)，黑加侖花色苷提取物 （Anthocyanins from Blackcurrant，ACB）具有抑制肝細(xì)胞癌[2]，清除自由基和抑制胃癌細(xì)胞增殖[3]，減少動(dòng)脈粥樣硬化血栓的形成，抗炎癥[4]和抗疲勞作用[5]等功能。禽白血病是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）引起的以造血細(xì)胞惡性增生為主的一類傳染病。目前ALV 分為A～J 10個(gè)亞群，A、B、C、D為外源性病毒，E為內(nèi)源性病毒[6]。近年來，在我國(guó)不同規(guī)模的養(yǎng)雞場(chǎng)中，由雞群中經(jīng)典外源性ALV-A感染而引起的惡性腫瘤的病例顯著上升，已給養(yǎng)殖業(yè)造成了很大經(jīng)濟(jì)損失[7]。因此，作者在結(jié)合國(guó)內(nèi)外對(duì)ACB的抗癌功能研究的基礎(chǔ)上，采用細(xì)胞模型，通過ACB對(duì)ALV-A誘導(dǎo)的DF1細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及細(xì)胞存活情況的影響，在體外開展其抗病毒活性的研究。本研究結(jié)果為ACB預(yù)防ALV-A病毒藥物的開發(fā)提供理論依據(jù)，并為人類預(yù)防白血病病毒提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

黑加侖花色苷粉:購(gòu)自北京綠色金可生物技術(shù)股份有限公司；DF1細(xì)胞、ALV-A病毒:由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧所提供；高糖DMEM培養(yǎng)基:購(gòu)自Hyclone公司；胎牛血清（FBS）:購(gòu)自澳大利亞Gibco公司；胰蛋白酶:購(gòu)自美國(guó) BD 公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽 （MTT）、二甲基亞砜（DMSO）:購(gòu)自 Sigma 公司；鹽酸阿霉素（DOX）:上海生工；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

液質(zhì)聯(lián)用儀（HPLC 1200系列，MS 6310系列）:Agilent公司；超凈工作臺(tái)YT-CJ-2NB:北京亞泰克隆實(shí)驗(yàn)科技開發(fā)中心；倒置生物顯微鏡BDS200:OPTEC奧特光學(xué)；CO2水套式培養(yǎng)箱:Thermo公司；細(xì)胞自動(dòng)計(jì)數(shù)分析儀CYT-100:CYTORECON公司；酶標(biāo)儀550:Bio Rad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑加侖花色苷的主要成分分析

1）樣品制備:ACB粉首先用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液稀釋成質(zhì)量濃度為1 mg/mL母液，0.22 μm針式過濾器過濾，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2）HPLC分析條件:紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng):520 nm；流動(dòng)相:A 5%甲酸水溶液，B 100%乙腈；分離柱:C18（4.6 mm ×150 mm，5 μm）。進(jìn)樣量 5 μL，流速 1 mL/min，柱溫25℃，梯度洗脫程序?yàn)?0～8 min，13%～22%B；8 ～15 min，22% ～23%B；15 ～20 min，23% ～100%B；20～25 min，100%B；25～26 min，100%～13%B；26～33 min，13%B。

3）MS分析條件:采用正離子模式，掃描范圍為100～1 500（m/z）；N2流速為 12 L/min；噴霧器壓力為310 kPa；干燥氣溫度為350℃。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)[8]所描述的細(xì)胞培養(yǎng)方法，按體積比10∶1的胎牛血清與高糖DMEM培養(yǎng)基混合，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中對(duì)DF1細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，隔天傳代，調(diào)整細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，一般以傳代數(shù)為3～6生長(zhǎng)良好的細(xì)胞，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 黑加侖花色苷對(duì)DF1的毒性試驗(yàn) 為了解ACB對(duì)DF1的細(xì)胞毒性，采用常規(guī)MTT實(shí)驗(yàn)方法[9]，取生長(zhǎng)良好的DF1細(xì)胞（細(xì)胞懸浮濃度為2～3×105 cells/mL），每孔 200 μL，接種于 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，置于5%CO237℃培養(yǎng)24 h后，對(duì)照組不加ACB，樣品組每孔內(nèi)分別加入ACB使其終質(zhì)量濃度分別為 2、4、6、8、10、12、14 μg/mL，每個(gè)濃度設(shè) 6 個(gè)平行孔，然后置于培養(yǎng)箱內(nèi)，分別在 24、48、72、96 h后，棄除培養(yǎng)液，每孔內(nèi)分別入MTT溶液10 μL，37℃繼續(xù)孵育4 h后，終止培養(yǎng)，棄除上清液后，每孔加入170 μL二甲基亞砜，微量振蕩10 min，使MTT還原產(chǎn)物完全溶解，用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定對(duì)照組和樣品組各孔吸光度（OD）值，通過OD值的大小間接反應(yīng)ACB的細(xì)胞毒性。

1.2.4 黑加侖花色苷體外抗ALV-A活性試驗(yàn)

1）黑加侖花色苷體外的預(yù)防病毒試驗(yàn):按照1.2.3 ACB對(duì)DF1的毒性試驗(yàn)方法，取生長(zhǎng)良好的200 μL細(xì)胞懸液，置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，約80%形成單層細(xì)胞，棄生長(zhǎng)液，向孔中加入樣品稀釋后的樣品母液，使其終質(zhì)量濃度為 2、4、6、8、10 μg/mL，37℃孵育1 h后，加入20 μL ALV-A病毒液再孵育1 h，2%FBS的細(xì)胞維持液每孔補(bǔ)至200 μL。分別在24、48、72、96 h后， 采用 MTT法在 490 nm 測(cè)定OD值。試驗(yàn)設(shè)細(xì)胞對(duì)照、病毒對(duì)照和阿霉素對(duì)照，6個(gè)平行孔，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

2）黑加侖花色苷體外的治療病毒試驗(yàn):同1.2.3方法，準(zhǔn)備4個(gè)DF1長(zhǎng)成約80%單層細(xì)胞的96孔板，棄生長(zhǎng)液，每孔加20 μL ALV-A病毒液，37℃孵育1 h后，向孔中加入樣品母液，使其終質(zhì)量濃度分別為 2、4、6、8、10 μg/mL， 細(xì)胞維持液補(bǔ)液體至200 μL。 分別培養(yǎng)至 24、48、72、96 h 后，采用 MTT法在490 nm測(cè)定OD值。

1.2.5 黑加侖花色苷與ALV-A對(duì)DF1細(xì)胞形態(tài)學(xué)試驗(yàn) 按照1.2.4實(shí)驗(yàn)方法，取生長(zhǎng)良好的DF1細(xì)胞（細(xì)胞懸浮濃度為 5～7×105cells/mL），接種于 25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)成單層，棄生長(zhǎng)液，加入500 μL ALV-A病毒液，37℃孵育1 h后，向孔中加入ACB母液，使其終質(zhì)量濃度分別為2 μg/mL和8 μg/mL，細(xì)胞維持液補(bǔ)液體至5 mL。試驗(yàn)設(shè)細(xì)胞對(duì)照、病毒對(duì)照和治療對(duì)照。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)采用Origin8軟件作圖、Agilent ChemDF1ation Rev.A.09.01 software和DPS統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)均以平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差（±SD）表示，采用 Duncan 新復(fù)極差多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑加侖花色苷的HPLC-MS成分分析

黑加侖花色苷的HPLC色譜圖見圖1。

圖1 黑加侖主要花色苷的HPLC色譜圖（520 nm）Fig.1 HPLC profiles（520 nm） of the major anthocyanins from Blackcurrant

由圖1可知，黑加侖主要含兩種成分。作者鑒定出兩種花色苷，見表1，與文獻(xiàn)[10]鑒定花色苷組分相似，飛燕草及矢車菊素類花色苷為其主要成分。然而與前人研究結(jié)果不同的是，作者未檢測(cè)出天竺葵色素類花色苷，可能是黑加侖的品種、采收時(shí)間及其種植地域等因素導(dǎo)致。

表1 黑加侖中主要的花色苷成分Table 1 Major anthocyanin components of Blackcurrant

2.2 黑加侖花色苷對(duì)DF1細(xì)胞毒性的研究

研究不同質(zhì)量濃度的ACB對(duì)DF1單層細(xì)胞的毒性作用。從表2可以看出:細(xì)胞對(duì)照組在72 h與96 h的OD值大小一致，無顯著水平差異，說明96 h時(shí)為細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到最大程度的時(shí)間值。同一時(shí)間段下，當(dāng)在質(zhì)量濃度小于10 μg/mL各處理組，隨著ACB質(zhì)量濃度的增加，OD值均比對(duì)照組高或者無水平差異，具有量效依賴性，說明ACB對(duì) DF1細(xì)胞的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用或者無毒性作用；當(dāng)ACB質(zhì)量濃度高于10 μg/mL，各處理組OD值與細(xì)胞對(duì)照相比，OD值呈下降趨勢(shì)，DF1生長(zhǎng)受到不同程度抑制，有顯著性差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在24、48、72、96 h四個(gè)時(shí)間段中，質(zhì)量濃度小于10 μg/mL各處理組均顯著高于對(duì)照組，但是在時(shí)間上的水平差異并不顯著。本研究體外試驗(yàn)時(shí)加入ACB，對(duì)正常DF1細(xì)胞的有無細(xì)胞毒性作用，當(dāng)ACB質(zhì)量濃度大于10 μg/mL時(shí)，各細(xì)胞組存活情況顯著下降，說明10 μg/mL是ACB對(duì)DF1細(xì)胞無細(xì)胞毒性的最大安全質(zhì)量濃度。賈娜等[11]研究證實(shí)黑加侖花色苷具有清除自由基能力，推測(cè)ACB能清除細(xì)胞產(chǎn)生有害物質(zhì)，因此一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)ACB可能提高了DF1細(xì)胞機(jī)能，從而促進(jìn)其生長(zhǎng)。

2.3 黑加侖花色苷體外抑制ALV-A活性的研究

阿霉素（DOX）為常見的抗腫瘤藥細(xì)胞毒類藥物，對(duì)白血病有明顯的治療效果[12]。本試驗(yàn)前期已探討出DOX質(zhì)量濃度為200 ng/mL對(duì)禽白血病A亞群有良好的治療效果，為本研究作為很好的藥物對(duì)照樣品。本實(shí)驗(yàn)在ACB對(duì)DF1生長(zhǎng)影響的最大質(zhì)量濃度在10 μg/mL范圍內(nèi)，展開對(duì)ACB抗ALV-A活性的研究。

表 2 ACB 對(duì) DF1 細(xì)胞毒性（±s，n=6）Table 2 Cytotoxicity of ACB on DF1 cell（±s，n=6）

表 2 ACB 對(duì) DF1 細(xì)胞毒性（±s，n=6）Table 2 Cytotoxicity of ACB on DF1 cell（±s，n=6）

注：采用Duncan新復(fù)極差多重比較法分析，不同字母表示每行時(shí)間之間的5%顯著水平差異，斜體字母表示每列質(zhì)量濃度之間的5%顯著水平差異。

質(zhì)量濃度/（μg/mL）2448時(shí)間/h 7296 0 2 4 6 8 1 0 12 14 0.591±0.026bbc 0.681±0.036ca 0.664±0.006aab 0.648±0.056cab 0.689±0.076ba 0.596±0.022bbc 0.523±0.013cc 0.433±0.063bd 0.860±0.049aa 0.868±0.031ba 0.861±0.046ba 0.840±0.040ba 0.867±0.052aa 0.845±0.022aa 0.728±0.028ab 0.667±0.021ab 0.902±0.059aa 0.893±0.025aba 0.880±0.044aba 0.928±0.029aa 0.931±0.040aa 0.872±0.042aa 0.680±0.038ab 0.512±0.062cc 0.914±0.043aa 0.952±0.074aa 0.964±0.051aa 0.952±0.024aa 0.959±0.026aa 0.905±0.029aa 0.629±0.064bb 0.420±0.013bc

2.3.1 黑加侖花色苷對(duì)ALV-A的預(yù)防試驗(yàn)結(jié)果研究ACB對(duì)ALV-A的預(yù)防作用，即向DF1單層細(xì)胞預(yù)先加入ACB，再加入ALV-A感染細(xì)胞，起到預(yù)先防治作用。從表3可以看出，在各時(shí)間段下，藥物阿霉素對(duì)照的OD值均高于病毒組，有顯著性差異，說明阿霉素對(duì)ALV-A起到了治療作用。同一時(shí)間下，ACB各質(zhì)量濃度處理組的DF1細(xì)胞OD值均顯著高于病毒對(duì)照組，具有量效依賴關(guān)系。其中72 h時(shí)，添加ACB質(zhì)量濃度8 μg/mL的OD值為0.874，明顯高于病毒對(duì)照OD值0.789，有顯著性差異，說明在體外ACB質(zhì)量濃度8 μg/mL對(duì)ALV-A病毒有一定的預(yù)防作用。在作用時(shí)間效應(yīng)上，ACB對(duì)ALV-A抑制作用也比較明顯，但是在同質(zhì)量濃度間差異性比較小。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:ACB各質(zhì)量濃度處理對(duì)ALV-A的具有預(yù)防作用，可明顯抑制ALVA在DF1細(xì)胞上的增殖。陶欣藝等[13]研究表明，花色苷能抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，ACB可能通過提高細(xì)胞機(jī)體內(nèi)的抗氧化酶類活性，減少由有害因素引起自由基的增加，從而減慢ALV-A在宿主細(xì)胞上的增殖。

表3 不同質(zhì)量濃度ACB體外對(duì)ALV-A的預(yù)防效果Table 3 Influence of prevention on ALV-A under different concentration of ACB in vitro

2.3.2 黑加侖花色苷對(duì)ALV-A的治療試驗(yàn)結(jié)果研究ACB對(duì)ALV-A的治療作用，即加入ALV-A預(yù)先感染DF1單層細(xì)胞后，再用ACB處理，起到治療作用。從表4可以看出，阿霉素藥物治療對(duì)照組的各OD值均高于病毒組，治療效果明顯；同一時(shí)間下，ACB各質(zhì)量濃度處理組的OD值均顯著高于ALV-A病毒對(duì)照組，隨著ACB質(zhì)量濃度增加，其OD值逐漸上升，差異顯著，呈量效依賴關(guān)系。其中在72 h時(shí)，ACB質(zhì)量濃度8 μg/mL時(shí)的OD值為0.843，與ALV-A病毒對(duì)照的OD值為0.753，呈顯著性差異。因此，在體外ACB對(duì)ALV-A病毒具有一定的治療作用。

表4 不同質(zhì)量濃度ACB體外對(duì)ALV-A的治療效果Table 4 Influence of treatment on ALV-A under different concentration of ACB in vitro

作者研究發(fā)現(xiàn)，ACB對(duì)ALV-A的預(yù)防作用比治療作用明顯。在相同質(zhì)量濃度下，預(yù)防試驗(yàn)的OD值比治療試驗(yàn)的高，結(jié)果見表3，4。提示ACB對(duì)ALV-A的預(yù)防作用比治療作用顯著，推測(cè)這可能與細(xì)胞性繼發(fā)作用有關(guān)[14]。運(yùn)用ACB進(jìn)行干擾溶酶體膜通透性，減緩細(xì)胞自溶速度，從而保護(hù)正常細(xì)胞。因此，給家禽添加適量ACB的飼養(yǎng)，能增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒能力，對(duì)ALV-A起到早期預(yù)防作用。

2.4 黑加侖花色苷與ALV-A對(duì)DF1細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

觀察發(fā)現(xiàn)，DF1單層細(xì)胞感染ALV-A病毒后，一般在5 d左右出現(xiàn)比較明顯的病變，表現(xiàn)為細(xì)胞脫落、形態(tài)改變，或形成病斑。正常DF1形成單層細(xì)胞后，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或扁平星形，大小均勻[15]。生長(zhǎng)至5 d，采用倒置顯微鏡圖顯示:圖2a為正常DF1細(xì)胞對(duì)照，細(xì)胞形態(tài)較為完整，有部分細(xì)胞脫離單層，是由于培養(yǎng)5 d后其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗和有害代謝產(chǎn)物積累而導(dǎo)致；圖2b顯示ACB質(zhì)量濃度為8 μg/mL處理正常細(xì)胞，單層細(xì)胞表面完整，折光性好，無空隙，很少破碎死亡，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好；圖2C為DF1細(xì)胞受ALV-A病毒感染，出現(xiàn)明顯細(xì)胞形態(tài)完全改變，空泡化，大部分細(xì)胞已經(jīng)脫離單層，發(fā)生嚴(yán)重的病變；圖2d為阿霉素藥物對(duì)照，只有少量細(xì)胞脫離單層，細(xì)胞形態(tài)較為完整；圖2e為ACB質(zhì)量濃度2 μg/mL作用于ALV-A誘導(dǎo)的DF1形態(tài)，結(jié)果顯示有細(xì)胞脫離單層，細(xì)胞間隙增加，占70%的細(xì)胞保持單層狀態(tài)；圖2f顯示ACB質(zhì)量濃度8 μg/mL作用于ALV-A誘導(dǎo)的DF1形態(tài)，細(xì)胞有部分脫落，約80%的細(xì)胞保持單層狀態(tài)，與圖2E比較，其細(xì)胞形態(tài)較好。因此，ACB能保護(hù)DF1的細(xì)胞形態(tài)，對(duì)ALV-A病毒繁殖有一定的抑制作用。

圖2 ACB對(duì)DF1細(xì)胞形態(tài)的影響（×250）Fig.2 Effect of ACB on DF1 cell morphology under microscope （× 250）

3 結(jié)語

目前我國(guó)對(duì)花色苷類作為抗病毒藥物的研究相對(duì)比較薄弱，主要集中在花色苷抗腫瘤的研究上，對(duì)禽白血病病毒的系統(tǒng)研究還不夠深入，對(duì)花色苷抗病毒的藥理作用研究才處于起步階段。作者通過研究表明，黑加侖含有飛燕草色素-3-鼠李糖苷-5-葡萄糖苷和矢車菊色素-3-鼠李糖苷-5-葡萄糖苷兩種主要花色苷成分；黑加侖花色苷在體外具有一定的抑制禽白血病A亞群病毒增殖作用，并隨劑量的增大呈量效依賴關(guān)系，同時(shí)對(duì)DF1細(xì)胞抵抗力有明顯的增強(qiáng)作用。作者用黑加侖花色苷混合物進(jìn)行抗病毒研究，其抗病毒效果其含有的花色苷種類有關(guān)，具體哪種花色苷單體或者花色苷復(fù)合物起作用更佳，其確切機(jī)制還有待于深入研究。

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