發(fā)酵對(duì)中藥減毒增效的研究進(jìn)展

楊光明 ， 涂 霞 ， 潘 揚(yáng) *，

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 國家中醫(yī)藥管理局中藥炮制標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)研究室，江蘇 南京，210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥用菌與中藥生物技術(shù)研究所，江蘇 南京，210029）

中藥有毒自古有之，《神農(nóng)本草經(jīng)》把中藥分為上、中、下三品，指出下品“多毒，不可久服”；明代李時(shí)珍在《本草綱目》中列有毒草專列，僅此記載就有47種毒性藥；《中華人民共和國藥典》2010年版收載毒性中藥82個(gè)，其中大毒品種10個(gè)，有毒品種41個(gè)，小毒品種31個(gè)。中藥的毒性，在中醫(yī)古籍中即中藥的偏性。它與四氣五味、升降浮沉等都屬于中藥性能的范疇。長(zhǎng)期的中醫(yī)藥臨床實(shí)踐證明，毒性中藥對(duì)于疾病的防治具有十分積極的意義，尤其在救治疑難重癥方面每起沉疴，素有“以毒攻毒”之說。但有毒中藥的毒性常常限制了其臨床應(yīng)用。有毒中藥通常要經(jīng)過特殊的方法加工，如加熱、水處理、加輔料、制霜等，傳統(tǒng)上稱為“炮制”，以達(dá)到減毒增效的目的。

隨著生物科技的發(fā)展，國內(nèi)外逐步重視對(duì)現(xiàn)代發(fā)酵應(yīng)用于中藥的研究開發(fā)，并已取得了很大進(jìn)展[1-4]。中藥發(fā)酵根據(jù)其發(fā)展歷史分為傳統(tǒng)發(fā)酵與現(xiàn)代發(fā)酵。傳統(tǒng)發(fā)酵是發(fā)酵工業(yè)中一項(xiàng)古老的工藝。目前所指的中藥發(fā)酵基本上是現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)，其關(guān)鍵條件是純種大規(guī)模集約化培養(yǎng)，發(fā)酵炮制是建立在傳統(tǒng)炮制方法基礎(chǔ)上的現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)，具有保護(hù)中藥活性中心免遭破壞以及對(duì)中藥毒性成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾以產(chǎn)生新成分的優(yōu)勢(shì)。發(fā)酵為毒性中藥產(chǎn)生新藥效，擴(kuò)大適應(yīng)癥提供了一個(gè)嶄新的途徑，用發(fā)酵炮制中藥使中藥減毒增效的研究也越來越多。作者在大量文獻(xiàn)調(diào)研的基礎(chǔ)上，從動(dòng)物、植物、礦物藥三個(gè)方面分別詳細(xì)綜述了發(fā)酵炮制在中藥減毒增效方面的應(yīng)用和發(fā)展。

1 發(fā)酵炮制在毒性中藥減毒增效中的應(yīng)用

我國早在北魏時(shí)期就已應(yīng)用微生物發(fā)酵炮制中藥，實(shí)現(xiàn)了增強(qiáng)中藥藥效、改變藥性的目的。傳統(tǒng)中藥的發(fā)酵炮制品有神曲、建神曲、半夏曲、沉香曲、采云曲、紅曲、淡豆豉、百藥煎、片仔癀等，在長(zhǎng)期臨床應(yīng)用中均未出現(xiàn)毒性反應(yīng)事件?，F(xiàn)代藥理毒理實(shí)驗(yàn)也證明中藥發(fā)酵制劑的安全性。如韓春楊等[5]采用由黃芪、黨參、茯苓、甘草、神曲、麥芽和山楂組成的復(fù)方發(fā)酵制劑經(jīng)過實(shí)驗(yàn)認(rèn)定該制劑在短期內(nèi)使用安全，毒性級(jí)別應(yīng)屬于“實(shí)際無毒級(jí)”，是一種比較安全的制劑。蔣保季等[6-7]對(duì)人工發(fā)酵培育冬蟲夏草進(jìn)行毒性研究，人工發(fā)酵培育的冬蟲夏草急性毒性和亞慢性毒性均未見異常，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體細(xì)胞、生殖細(xì)胞以及細(xì)菌均未見致突變作用，無遺傳毒性，證明該物質(zhì)毒理學(xué)上是安全的。王衛(wèi)倩等[8]首次應(yīng)用雙向性固體發(fā)酵技術(shù)將雷公藤進(jìn)行減毒，并將不同發(fā)酵時(shí)間的靈雷菌質(zhì)進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)，充分表明雙向性固體發(fā)酵技術(shù)是降低雷公藤毒性的有效途徑。莊毅[9]研究的槐耳菌質(zhì)所提的清膏經(jīng)過動(dòng)物急性毒性試驗(yàn)、長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)、特殊毒理試驗(yàn)等，表明槐耳菌質(zhì)的安全性。槐耳菌質(zhì)及其沖劑對(duì)中晚期原發(fā)性肝癌有效，早已被批準(zhǔn)為中藥一類新藥正式投產(chǎn)。急性毒性試驗(yàn)?zāi)茏C明發(fā)酵方法對(duì)中藥解毒的可行性，但有毒中藥經(jīng)過發(fā)酵以后進(jìn)行毒性比較的報(bào)道較少，值得重視。

1.1 發(fā)酵在毒性植物類中藥中的應(yīng)用

越來越多的研究報(bào)道發(fā)酵應(yīng)用于炮制毒性植物藥以實(shí)現(xiàn)減毒增效的目的。大黃中結(jié)合型蒽醌是瀉下的主要成分，在很多情況下也可能引起副作用，而游離型蒽醌為抗菌、抗腫瘤等的主要有效成分，瀉下作用極弱。戴萬生、趙榮華[6]將發(fā)酵法應(yīng)用于大黃炮制，大黃經(jīng)釀酒酵母、面包酵母37℃分別發(fā)酵16 d后，其總蒽醌含量?jī)H略有降低，與傳統(tǒng)炮制方法比較，保存了更多的大黃總蒽醌，其中起到瀉下作用的結(jié)合型蒽醌含量降低至生品的一半左右，而作為抗菌、抗腫瘤的主要成分的游離型蒽醌含量增加了6倍左右。說明發(fā)酵法能使大黃結(jié)合型蒽醌轉(zhuǎn)化為游離型蒽醌，從而緩和大黃峻烈的瀉下作用及對(duì)胃腸道的不良反應(yīng)。還發(fā)現(xiàn)大黃發(fā)酵后可能被分解為蒽醌甙元。

五倍子含有五倍子鞣質(zhì)、沒食子酸等。有收斂止瀉、止血作用，是一種常見的對(duì)肝臟有毒副作用的含鞣質(zhì)類中藥，具有斂肺降火、澀腸止瀉、固精縮尿、止汗、止血的作用，其活性機(jī)理主要是由于它所含的鞣酸與細(xì)胞中的蛋白質(zhì)結(jié)合成不溶于水的沉淀物，從而抑制了細(xì)胞分泌，促進(jìn)水液的再吸收而發(fā)揮收斂作用。但鞣酸在腸道內(nèi)會(huì)遇食物中的蛋白質(zhì)，并與之結(jié)合，因而降低了它的作用。為了克服這一缺點(diǎn)，鄭利華等[11]根據(jù)臨床酶學(xué)的有關(guān)理論，采用含有根霉菌的酵曲發(fā)酵五倍子，曲中還含有L-賴氨酸等物質(zhì)。利用根霉菌能促進(jìn)L-賴氨酸生成的作用形成更多的L-賴氨酸。L-賴氨酸能促進(jìn)胃腸道粘膜吸收食物中的蛋白質(zhì)，有效地減少大分子沉淀物的形成與對(duì)胃黏膜的刺激，因此能有效地避免鞣酸在胃腸道內(nèi)競(jìng)爭(zhēng)性消耗，從而提高了五倍子的收斂作用，并降低或消除了部分患者服用后食欲不振的副反應(yīng)。瞿燕[12]測(cè)定了五倍子生品、發(fā)酵品和水解產(chǎn)物中五倍子鞣質(zhì)和沒食子酸的含量并進(jìn)行了抗炎、抗菌、止咳、祛痰藥理實(shí)驗(yàn)的對(duì)比。結(jié)果表明：發(fā)酵品和水解產(chǎn)物中沒食子酸的含量高，抗菌和祛痰作用強(qiáng)于生品。

馬錢子是一味中醫(yī)傳統(tǒng)使用的“有毒中藥”。成人用5～10 mg即可發(fā)生中毒現(xiàn)象，30 mg可致死亡。馬錢子有散結(jié)消腫、通絡(luò)止痛的功效，常借其“毒藥猛劑善起沉疴”，而用于風(fēng)濕頑痹、麻木癱瘓、跌打損傷、疽癰腫痛等病證?，F(xiàn)代研究證實(shí)，馬錢子所含生物堿中士的寧（番木鱉堿）與馬錢子堿（布魯生）為其主要有效成分及毒性成分，含量各約為1～1.4%。馬錢于堿藥效只有士的寧的1／40，而毒性則有士的寧的1／20[13]。為了降低馬錢子的毒性，臨床上常采用砂燙、油炸、爆壓法、甘草制、醋泡、醋炙、尿泡等，或同甘草、綠豆加水共煮等方法減毒。潘揚(yáng)等[14]在莊毅[15]“雙向固體發(fā)酵技術(shù)”基礎(chǔ)上將馬錢子（藥材生品）與靈芝、槐耳、猴頭等20種真菌共同培養(yǎng)，產(chǎn)生馬錢子“藥性菌質(zhì)”。發(fā)現(xiàn)雙向發(fā)酵后菌絲體生長(zhǎng)良好的“藥性菌質(zhì)”中馬錢子類生物堿成分發(fā)生了質(zhì)和量的明顯變化，士的寧、馬錢子堿的含量均呈下降的趨勢(shì)，與生品相比分別下降60%、30%左右。而士的寧氮氧化物、馬錢子堿氮氧化物有不同程度的增加，且指紋譜中顯示出5個(gè)新產(chǎn)生的或含量變化較大的未知成分，在對(duì)紅栓菌發(fā)酵后的馬錢子菌質(zhì)的急性毒性研究中，發(fā)現(xiàn)紅栓菌質(zhì)的毒性已顯著下降，一次性灌胃給藥小鼠比未發(fā)酵者的LD50數(shù)值增加了16.6%。同時(shí)也觀察了[16]另外6種不同真菌——裂褶菌、竹黃、單色云芝、雞油菌、白僵菌和蟬花對(duì)馬錢子毒性和鎮(zhèn)痛、抗炎作用的影響。以半數(shù)致死量（LD50）為指標(biāo)，測(cè)定馬錢子生品和炮制品及6種不同發(fā)酵品經(jīng)灌胃給藥對(duì)小鼠的急性毒性；以雙氯芬酸鈉和生品為陽性對(duì)照，觀察6種不同發(fā)酵品對(duì)腹腔注射醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)的抑制（鎮(zhèn)痛）作用以及對(duì)外涂巴豆油所致鼠耳殼腫脹的減輕（抗炎）作用。結(jié)果表明，馬錢子通過6種真菌發(fā)酵后毒性降低，與炮制品基本一致；且它保持了馬錢子原有的鎮(zhèn)痛和抗炎作用，提示發(fā)酵可以為馬錢子的降毒保效提供一條新途徑。 潘揚(yáng)等[17]還采用溶劑提取、硅膠柱色譜等方法對(duì)馬錢子發(fā)酵品的生物堿成分進(jìn)行分離純化，根據(jù)化合物的理化常數(shù)和波譜數(shù)據(jù)鑒定其結(jié)構(gòu)。結(jié)果從馬錢子發(fā)酵品中共分離得到10個(gè)生物堿成分，分別鑒定為士的寧（1）、馬錢子堿（2）、偽士的寧（3）、16-甲氧基士的寧（4）、番木鱉次堿（5）、士的寧氮氧化物（6）、馬錢子堿氮氧化物（7）、士的寧氯甲氯化物（8）、馬錢子堿氯甲氯化物（9）和喜樹次堿（10）。提示馬錢子發(fā)酵品的大部分化學(xué)成分仍然是吲哚類生物堿，其中僅有10是單萜吡啶生物堿，為首次從該種植物中分離得到；化合物4是首次從該植物的種子中分離得到；化合物8和9可能為氯仿提取過程中產(chǎn)生的人工加合物。迄今未見朱紅栓菌中含有上述生物堿的報(bào)道。與生品相比，馬錢子發(fā)酵品中生物堿成分發(fā)生了一定的變化，其中化合物4、6、7和10可能為發(fā)酵品新增成分，這些生物堿成分的鑒定為馬錢子發(fā)酵“去毒存效”原理提供了理論依據(jù)。

雷公藤為植物衛(wèi)矛科植物雷公藤Tripterygium wilfordii Hook的根，含雷公藤堿、雷公藤定堿等多種生物堿、二萜內(nèi)酯、雷藤酮及衛(wèi)矛醇等，清代趙學(xué)敏在《本草綱目拾遺》已詳細(xì)記載了其毒性：“采之毒魚，凡蚌螺亦死，其性最烈，以其草煙獯蠶子則不生”。有人誤服其葉2～3片可中毒，服嫩芽7個(gè)或根皮30 g以上可以引起死亡，甚至食其花蜜也可發(fā)生中毒。雷公藤能祛風(fēng)除濕，活血通絡(luò)，消腫止痛，殺蟲解毒。雷公藤甲素抗腫瘤活性明顯強(qiáng)于紫杉醇，對(duì)卵巢癌和胃癌細(xì)胞等作用尤其明顯。王衛(wèi)倩等[9]運(yùn)用雙向性固體發(fā)酵技術(shù)得到靈雷菌質(zhì)，并對(duì)其進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)。發(fā)酵30 d的靈雷菌質(zhì)急性毒性最低，這充分表明雙向性固體發(fā)酵技術(shù)是降低雷公藤毒性的有效途徑，同時(shí)還對(duì)靈雷菌質(zhì)的藥效進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)靈雷菌質(zhì)仍保持一定的免疫抑制作用。寧黎麗[18]利用微生物轉(zhuǎn)化技術(shù)對(duì)雷公藤甲素進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，使用篩選出的短刺小克銀漢霉對(duì)雷公藤甲素1a進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，得到四個(gè)新的轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，利用黑曲霉對(duì)雷公藤內(nèi)酯酮2a進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，得到一個(gè)轉(zhuǎn)化后的新產(chǎn)物，體外細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)五個(gè)腫瘤細(xì)胞株具有一定的細(xì)胞毒活性。張普照等[19]以雷公藤（帶皮的根）經(jīng)藥用真菌G發(fā)酵后的藥性菌質(zhì)為研究對(duì)象，采用兩種檢測(cè)手段探討解毒持效發(fā)酵過程中化學(xué)成分的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。雷公藤經(jīng)藥用真菌發(fā)酵后，改變了原藥材的化學(xué)成分組成。結(jié)合毒理藥效實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)藥性菌質(zhì)具有免疫抑制活性但比原藥材急性毒性低，因此證明該方法在雷公藤解毒持效中的可行性。在藥用真菌代謝中某些酶的催化下，雷公藤甲素的某個(gè)化學(xué)鍵斷裂或者和別的化合物發(fā)生反應(yīng)且反應(yīng)速度快，因此雷公藤藥材經(jīng)藥用真菌發(fā)酵后甲素含量急劇下降。

苦參為豆科植物苦參Sophora flavescens Ait.的干燥根，含有苦參堿和氧化苦參堿?？鄥⒌母头N子都有毒。苦參堿具有抗癌活性，氧化苦參堿可防止小鼠因MMC、環(huán)磷酰胺所致小鼠白細(xì)胞減少癥。李雁群等[20]將苦參水煎汁接種靈芝發(fā)酵，采用細(xì)胞抑制試驗(yàn)初步評(píng)價(jià)了苦參水煎汁靈芝發(fā)酵液的藥效學(xué)價(jià)值。作者觀察到苦參的靈芝發(fā)酵液能減少細(xì)胞培養(yǎng)液上清中HBsAg和HBeAg的含量，這個(gè)結(jié)果顯示苦參靈芝發(fā)酵液可能具有抗HBV的作用。試驗(yàn)還表明，苦參經(jīng)過靈芝發(fā)酵以后，沒有明顯改變其抗HBV的藥效作用，相反還降低了毒性。

何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thumb.的干燥塊根，其藤莖稱 “夜交藤”。結(jié)合型蒽醌是何首烏致瀉和肝毒性的主要成分。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證實(shí)，何首烏中的蒽醌類物質(zhì)，具有降低膽固醇、降血糖、抗病毒、強(qiáng)心、促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)等作用，還有促進(jìn)纖維蛋白溶解活性作用，對(duì)心腦血管疾病有一定的防治作用；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，何首烏還有抗腫瘤作用。杜晨暉等[21]對(duì)不同菌株發(fā)酵的何首烏樣品及其發(fā)酵前后的化學(xué)成分進(jìn)行比較分析，并篩選出可以專一性降解何首烏中蒽醌類成分而不破壞其有效成分二苯乙烯苷的菌種。為降低何首烏的毒副作用，建立了一種炮制何首烏的新方法。

三七具有散瘀止血，消腫定痛之功效。三七總皂苷肌內(nèi)注射450 mg/kg對(duì)大鼠具有明顯的肝臟、腎臟毒性[22]。李國紅等[23]聯(lián)合采用枯草芽孢桿菌對(duì)三七根進(jìn)行發(fā)酵后，在對(duì)其中的皂苷成分的研究中發(fā)現(xiàn)，從發(fā)酵后的三七中分離到了人參皂苷Rh4，這種化合物未在發(fā)酵前檢測(cè)到，說明這種化合物是通過發(fā)酵產(chǎn)生的，可能是在發(fā)酵的過程中，三七須根的某些皂苷被微生物轉(zhuǎn)化為人參皂苷Rh4。馬偉光等[24]采用曲霉菌、根霉、毛霉和酵母菌為主要的發(fā)酵菌種，對(duì)粉碎的滇產(chǎn)三七根莖進(jìn)行了固態(tài)生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，認(rèn)為發(fā)酵法是發(fā)現(xiàn)和創(chuàng)新三七藥理活性的重要途徑。

喜樹堿和10-羥基喜樹堿是從珙桐科落葉喬木喜樹果實(shí)中提取的，喜樹堿具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，但同時(shí)又具有嚴(yán)重的胃腸毒性，如抑制骨髓功能和引起出血性膀胱炎等，制約了它的進(jìn)一步應(yīng)用，10-羥基喜樹堿目前除應(yīng)用于消化道腫瘤、肺癌、生殖系統(tǒng)腫瘤外，還對(duì)白血病等其他腫瘤也有良好的治療作用，活性高且毒性低，是極富前景的抗癌藥物。但它在喜樹中的含量?jī)H為十萬分之二，提取分離費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，朱關(guān)平[25]采用無毒黃曲霉菌株1100T-419將喜樹堿轉(zhuǎn)化為10-羥基喜樹堿，轉(zhuǎn)化率達(dá)50%以上。其中就是運(yùn)用微生物發(fā)酵技術(shù)將喜樹堿轉(zhuǎn)化為10-羥基喜樹堿，但是迄今為止尚未對(duì)喜樹的各用藥部位，尤其是抗癌活性很強(qiáng)的果實(shí)進(jìn)行過液體或固體生物發(fā)酵研究，相信開展這方面的工作可能會(huì)有除10-羥基喜樹堿含量增高之外的新發(fā)現(xiàn)。

長(zhǎng)春花有涼血降壓，鎮(zhèn)靜安神功效，長(zhǎng)春堿的主要毒性為抑制骨髓功能；長(zhǎng)春新堿對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、胃腸道的毒性較突出。從長(zhǎng)春花不同部位分離出100多種生物堿，但這些生物堿在植物體內(nèi)含量低，且植物生長(zhǎng)緩慢，資源短缺，限制了抗癌藥物的進(jìn)一步開發(fā)。人們又轉(zhuǎn)而進(jìn)行植物組培研究，但植物組培成本高，生產(chǎn)難度大，有效成分含量低，也未能成功應(yīng)用于生產(chǎn)。由于植物真菌對(duì)植物某些藥效成分的形成有重要影響，甚至?xí)a(chǎn)生和其寄主相同或相似的生理活性。楊顯志等[26]從長(zhǎng)春花葉中分離出一株無孢菌群菌株97CY3，從該菌的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)了長(zhǎng)春新堿化合物，經(jīng)HPLC分析其質(zhì)量濃度達(dá)到0.205 g/L。張玲琪等[23]首次報(bào)道從長(zhǎng)春花Catharanthus roseus（L.）G.Don莖的韌皮部中分離出尖孢鐮刀菌，為該植物的一種內(nèi)生真菌，并用TLC和HPLC對(duì)該菌的97CG3菌株培養(yǎng)物進(jìn)行了分析，初步結(jié)果表明，該真菌能產(chǎn)生抗癌藥長(zhǎng)春新堿成分。

潘揚(yáng)等[28]通過急性毒性實(shí)驗(yàn)及致炎、溶血作用比較了巴豆經(jīng)炮制與發(fā)酵后的毒性效應(yīng)，結(jié)果表明，炮制和發(fā)酵處理均可使巴豆毒性降低，但巴豆靈芝菌和白僵菌發(fā)酵品毒性更低。

1.2 發(fā)酵在毒性動(dòng)物類中藥中的應(yīng)用

事實(shí)上，與植物類中藥相比，發(fā)酵應(yīng)用于毒性動(dòng)物類中藥的研究報(bào)道很少。斑蝥主要含斑蝥素、脂肪等成分，臨床用于破血消癓，功毒蝕瘡，引赤發(fā)泡。斑蝥素對(duì)多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤有一定抑制作用，尤其當(dāng)腹水型腫瘤接種的瘤細(xì)胞數(shù)較少時(shí)，可見小鼠生存期延長(zhǎng)。其作用機(jī)制可能是抑制蛋白質(zhì)與核酸的合成。臨床上對(duì)皮膚、粘膜有強(qiáng)烈的刺激性，能引起充血，起泡，口服毒性很大，米炒能降低其毒性及矯正其氣味。李曉飛等[29]從鋸角豆芫菁Epicauta gorhami Marseul幼蟲蟲體身上分離得到的白色真菌，經(jīng)鑒定為球孢白僵菌Beauveria bassian，球孢白僵菌可以有效地降解斑蝥素，降解率達(dá)90.45%，可以利用這一研究來安全合理地應(yīng)用斑蝥素，并可以深入研究斑蝥素的生物降解產(chǎn)物的藥物活性。葉敏等[30]往桔梗懸浮培養(yǎng)體系中加入斑蝥素培養(yǎng)6 d，培養(yǎng)液分離純化得到混合存在的兩個(gè)轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，鑒定為一對(duì)差向異構(gòu)體1β-羥基斑蝥素和1α-羥基斑蝥素，且均為未見報(bào)道的新化合物。

水蛭素（hirudin）因最早從水蛭中分離得到而得名。天然水蛭素由65個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量7 000。水蛭素能同凝血酶的催化中心及纖維蛋白原結(jié)合中心發(fā)生不可逆的結(jié)合，使凝血酶失活，為目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)有力的凝血酶抑制劑。研究表明，水蛭素在腫瘤治療中也能發(fā)揮作用，它能防止腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，已證明有效的腫瘤有纖維肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、黑素瘤、淋巴瘤和白血病細(xì)胞等。水蛭素配合化學(xué)治療和放射治療，可促進(jìn)腫瘤中的血流從而增強(qiáng)療效。然而，水蛭素能阻止凝血酶的作用，引起內(nèi)臟廣泛出血。有腎毒性，可導(dǎo)致腎臟損害。莫煒等[31]構(gòu)建了重組雙功能水蛭素（r-RGD-Hirudin）cDNA的表達(dá)質(zhì)粒 RGD-Hirudin.pPIC9K，轉(zhuǎn)化入畢赤酵母中，經(jīng)篩選得到高表達(dá)的陽性克隆。種子菌經(jīng)過3 d發(fā)酵培養(yǎng)，其培養(yǎng)液上清液經(jīng)超濾濃縮、凝膠過濾層析和離子交換層析后，得到純度大于97%、比活性為12 000 ATU/mg的r-RGD-Hirudin，回收率大于60%，發(fā)酵產(chǎn)率為1 g/L。純化后r-RGD-Hirudin經(jīng)過SDS-PAGE，抗凝血酶活力分析、抗血小板聚集分析、質(zhì)譜分析及等電聚焦分析等方法鑒定，證明該表達(dá)產(chǎn)物為水蛭素的衍生物，具有抗凝血酶和抗血小板聚集雙重功能。周祥山等[32]研究重組畢赤酵母高密度發(fā)酵表達(dá)水蛭素過程中產(chǎn)生了4種具有較高比活的水蛭素異構(gòu)體，畢赤酵母發(fā)酵過程中水蛭素存在降解，Hir 65降解產(chǎn)生了Hir 62和Hir63。

劉高強(qiáng)等[33]研究了幾種藥用昆蟲對(duì)靈芝深層培養(yǎng)過程中細(xì)胞生長(zhǎng)和三萜產(chǎn)物形成的影響。結(jié)果表明，蜣螂蟲粉的添加，能顯著促進(jìn)靈芝胞外三萜的形成（P＜0.01）。劉高強(qiáng)等[34]還研究了幾種昆蟲的水提物和醇提物對(duì)靈芝深層發(fā)酵生產(chǎn)菌體和多糖的影響。結(jié)果表明，松毛蟲水提物能促進(jìn)靈芝菌體的生長(zhǎng)，其中斑蝥提取物對(duì)靈芝菌體的生長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的抑制作用。蜣螂水提物能顯著提高靈芝胞內(nèi)多糖的產(chǎn)量，地鱉蟲醇提物以及松毛蟲醇提物對(duì)胞內(nèi)多糖的生產(chǎn)也具有促進(jìn)作用。此外，蜣螂醇提物對(duì)胞外多糖的生產(chǎn)具有促進(jìn)作用。劉高強(qiáng)等[35]采用體外高通量篩選技術(shù)檢測(cè)了補(bǔ)加藥用昆蟲蜣螂前后靈芝發(fā)酵產(chǎn)物的體外抗腫瘤活性。在補(bǔ)加蜣螂發(fā)酵后，胞外三萜樣品對(duì)BEL7402細(xì)胞的抑制作用得到了增強(qiáng)，提示lucidone C可能增強(qiáng)了補(bǔ)加蜣螂后靈芝胞外總?cè)茖?duì)BEL7402細(xì)胞的抑制作用。以上都是研究昆蟲對(duì)靈芝發(fā)酵后的影響，中藥很多毒類藥材都有毒性，如斑蝥、青娘子、紅娘子、全蝎和蜈蚣等，這方面的發(fā)酵解毒研究值得期待。

1.3 發(fā)酵在毒性礦物類中藥中的應(yīng)用

要不是通過商業(yè)產(chǎn)品的生物浸出而回收金屬的技術(shù)，發(fā)酵應(yīng)用于毒性礦物類中藥幾乎不可能[36]。雄黃是常用的礦物藥，雄黃和含雄黃中成藥有多種療效，在中藥中具有舉足輕重的地位。但是雄黃常以未溶解狀態(tài)的粗糙礦物原粉入藥，造成用量大、毒性嚴(yán)重超標(biāo)，常有使用雄黃造成不良反應(yīng)者。因而雄黃和含雄黃中成藥在國際市場(chǎng)上受到了限制。杜文靜利用分離鑒定的一株高活性的氧化亞鐵硫桿菌（Acidithiobacillus ferrooxidans，簡(jiǎn)稱 At.f）對(duì)礦物藥雄黃進(jìn)行浸出處理，比較普通氧化亞鐵硫桿菌和經(jīng)耐砷馴化后的氧化亞鐵硫桿菌對(duì)雄黃的浸出效果，測(cè)定雄黃微生物浸出液的急性毒性，并初步研究雄黃微生物浸出液的體外、體內(nèi)抑菌作用。謝親建研究采用微生物對(duì)雄黃進(jìn)行生物浸出處理以提高其溶解度和生物利用度；以白血病K562和K562ADM細(xì)胞為模型，研究了雄黃的浸出液對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響及其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用；采用毛細(xì)管電泳分析法對(duì)雄黃生物浸出液進(jìn)行分離分析以期確定它的藥效成分；對(duì)雄黃生物浸出液的急性毒性和藥物動(dòng)力學(xué)進(jìn)行考察。李紅玉研究的雄黃微生物浸出液在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用已經(jīng)申請(qǐng)專利。

朱砂是常用的鎮(zhèn)靜安神藥，在中藥中具有舉足輕重的地位。但是朱砂常以未溶解狀態(tài)的粗糙礦物原粉入藥，造成用量大、毒性嚴(yán)重超標(biāo)，常有使用朱砂造成不良反應(yīng)者。因而朱砂和含朱砂中成藥在國際市場(chǎng)上受到了限制。蘇麗春[35]利用分離鑒定的一株高活性的At.f對(duì)礦物藥朱砂進(jìn)行浸出處理，研究其搖瓶浸出的最佳實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)朱砂浸出液的鎮(zhèn)靜安神和抗驚厥藥效實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了初步的探討，并初步檢驗(yàn)了朱砂浸出液的抑菌效果。

2 展望

中藥經(jīng)過發(fā)酵有很多優(yōu)點(diǎn)，目前對(duì)優(yōu)良菌種的篩選、優(yōu)化發(fā)酵終點(diǎn)的判斷，對(duì)已有活性成分和新成分的提取分離等研究較多，而對(duì)發(fā)酵減毒增效機(jī)理研究較少，建立發(fā)酵制品推廣應(yīng)用大規(guī)模生產(chǎn)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚屬空白。天然培養(yǎng)基中添加適量中藥成分的混合培養(yǎng)基研究有望成為未來的研究熱點(diǎn)。

我們認(rèn)為對(duì)發(fā)酵中藥的研究可以從以下幾個(gè)方面開展工作：1）加強(qiáng)功能性微生物的菌種選育工作；2）毒性中藥發(fā)酵減毒增效分子機(jī)理研究；3）中藥發(fā)酵技術(shù)及設(shè)備的研究；4）復(fù)合微生物發(fā)酵技術(shù)的研究；5）研究在發(fā)酵中藥過程中如何實(shí)現(xiàn)中醫(yī)理論的指導(dǎo)并采納現(xiàn)代中醫(yī)藥的新技術(shù)、新成果。

對(duì)中藥的成分進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，通過藥理篩選模型來確定轉(zhuǎn)化前后藥效的變化，需要中藥學(xué)、微生物學(xué)、分析化學(xué)、藥理學(xué)等多學(xué)科參與。隨著多學(xué)科的交叉發(fā)展，微生物發(fā)酵在有毒中藥的研究中必將取得長(zhǎng)足的發(fā)展，微生物發(fā)酵中藥也必將表現(xiàn)出強(qiáng)大的生命力。應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)大規(guī)模提取中藥的有效成分、將發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用于有毒中藥的炮制是一項(xiàng)很有前景的課題。同時(shí)，利用微生物發(fā)酵便于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化和與國際標(biāo)準(zhǔn)接軌，對(duì)擴(kuò)大中藥治療范圍、劑型改進(jìn)、創(chuàng)制新藥方面提供新的技術(shù)手段，有利于提高我國中藥綜合利用的現(xiàn)代化水平，給中藥研究注入新的內(nèi)容和活力，為中藥走向世界、造福全人類起著進(jìn)一步的推動(dòng)作用。

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