竹黃菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)竹紅菌素條件的優(yōu)化

呂騰飛 ， 丁彥蕊 ， 廖祥儒 ， 蔡宇杰 *

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫214122；3.江南大學(xué) 物聯(lián)網(wǎng)工程學(xué)院，江蘇 無錫214122）

竹黃（Shiraia bambusicola），俗稱竹花，赤團(tuán)子，竹赤團(tuán)子等[1]，屬于子囊菌亞門中的核菌綱、球殼目、肉座菌科（Hypocreaceae）、竹黃屬（Sharaia）。 竹黃主要寄主為箭竹屬和短穗竹屬植物，主要分布在江西、浙江、江蘇、湖北、湖南、安徽、貴州和云南等地，以及亞洲的日本[2]。是一種特異性寄生在某些竹子嫩枝上的藥用真菌，藥用部分為其子座，具有止咳祛痛、舒筋活絡(luò)、祛風(fēng)利濕等功效，可用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、坐骨神經(jīng)痛、急性肝炎等[3]，在民間常用其泡酒，用以治療跌打損傷、虛寒胃痛等癥[4-5]。竹紅菌素被認(rèn)為是竹黃中主要的有效成分之一，由多種苝醌類衍生物組成[6-7]。近年來發(fā)現(xiàn)竹紅菌素具有優(yōu)良的光敏殺傷腫瘤細(xì)胞和抑制艾滋病病毒的作用，并且是一種新型的光活化農(nóng)藥和潛在的光電轉(zhuǎn)化材料，在世界范圍內(nèi)正被廣泛的研究[8]。

從竹黃子座中直接提取獲得竹紅菌素的技術(shù)在國內(nèi)外都有報(bào)道[9]，然而竹黃野外采集資源有限，而且容易造成竹林衰敗。近年來，通過液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵的方法獲得竹紅菌素取得了一定的進(jìn)展[10-11]。項(xiàng)曉燕等（2012）通過優(yōu)化竹紅菌素的液態(tài)發(fā)酵條件，色素產(chǎn)量達(dá)到了7.68 mg/g菌體[12]；蔡宇杰等（2004）利用固態(tài)發(fā)酵生物合成竹紅菌素，色素產(chǎn)量達(dá)到了40 mg/kg培養(yǎng)基[9]，為解決竹紅菌素的來源提供了新思路。

相較于液態(tài)發(fā)酵，固態(tài)發(fā)酵具有節(jié)水節(jié)能的獨(dú)特優(yōu)勢，而且?guī)缀鯖]有廢液排放，屬于清潔生產(chǎn)技術(shù)，在發(fā)酵領(lǐng)域日益受到重視[13]。作者采用固態(tài)發(fā)酵的方法，研究了培養(yǎng)基組成、種齡、接種量、初始含水量和溫度等對竹紅菌素產(chǎn)量的影響，以期能為規(guī)?；a(chǎn)提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

竹黃菌 （Shiraia bambusicola）SUPER-H168:作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（g/dL）:馬鈴薯 20，葡萄糖 2，瓊脂2；pH 自然。

種子培養(yǎng)基 （g/dL）:馬鈴薯 20， 葡萄糖 2，KH2PO40.2，MgSO4·7H2O 0.05；pH 自然。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基:玉米（顆粒度 18～16目）25 g，麥秸稈（20 目）5 g，蒸餾水 30 mL，pH 自然。

上述培養(yǎng)基均在121℃下滅菌20 min。

1.3 方法

1.3.1 孢子懸液的制備 斜面種子于30℃培養(yǎng)5～7 d至長出大量孢子，用20 mL無菌水洗下孢子，玻璃珠將孢子充分打碎，配置成106個(gè)/mL的孢子懸浮液。

1.3.2 色素檢測方法 將固態(tài)培養(yǎng)物于烘箱中70℃烘干至恒重，準(zhǔn)確稱取1.00 g，研缽研碎，用30 mL無水乙醇在30℃條件下提取兩次，每次40 min，抽濾后得澄清液，用旋蒸儀蒸發(fā)干，甲醇溶解并適當(dāng)稀釋后，用分光光度計(jì)在465 nm處測定其吸光值[14]，根據(jù)回歸方程 y=0.036 4x+0.044 1（R2=0.999）計(jì)算色素的含量，其中y為吸光度值，x為色素質(zhì)量濃度（mg/L）。

1.3.3 玉米顆粒度和麥秸稈添加量的優(yōu)化 選擇不同的玉米粒徑和麥秸稈添加量進(jìn)行組合實(shí)驗(yàn)，以確定最佳的配比。

1.3.4 初始含水量的優(yōu)化 選擇初始含水量在35%～70%的各個(gè)水平，通過實(shí)驗(yàn)確定最適含水量。

1.3.5 培養(yǎng)溫度的優(yōu)化 固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基接種后，分別在 24、26、28、30、32 ℃條件下培養(yǎng)，以確定最佳培養(yǎng)溫度。

1.3.6 種齡的優(yōu)化 接種1.3.1所述孢子懸液2 mL于50 mL種子培養(yǎng)基中，在30℃、200 r/min分別振蕩培養(yǎng) 12，24，36，48，72 h 作為固態(tài)發(fā)酵的種子液。

1.3.7 接種量的優(yōu)化 每30 g固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)（以干重計(jì)）分別接種 1、2、3、4、5 mL 液體種子，以確定最佳的接種量。

1.3.8 外加碳、氮源以及無機(jī)鹽的優(yōu)化 以葡萄糖為 外 加 碳 源 ，NH4Cl 為 外 加 氮 源 ，CuSO4、MgSO4、CaCl2、KH2PO3、K2HPO4為無機(jī)鹽， 按照表 1設(shè)計(jì) 7因素3水平正交實(shí)驗(yàn)。

表1 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal design

2 結(jié)果及分析

2.1 玉米顆粒度和麥秸量的優(yōu)化

固態(tài)發(fā)酵中加入麥秸粉末有助于改善氧氣和熱量的傳遞情況，并且能使培養(yǎng)基蓬松，為菌絲體的生長提供良好的條件；但是麥秸量太多，在培養(yǎng)基制備過程中就會(huì)吸收更多的水分，而分配在玉米顆粒上的水分減少，使玉米顆粒在蒸料過程中不能充分糊化，從而影響菌體的生長。玉米顆粒度過小，導(dǎo)致培養(yǎng)基在蒸料過程中容易結(jié)塊，而顆粒度太大，又會(huì)影響菌體對玉米顆粒內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)的利用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。當(dāng)麥秸的添加量為3 g，玉米的顆粒度為0.78～0.95 mm時(shí)，色素的產(chǎn)量最高，達(dá)1.42%（色素含量占培養(yǎng)基干重，下同）。

表2 玉米顆粒度和麥秸稈量對色素產(chǎn)量的影響Table 2 Effect of straw powder and maize grits on yield of pigment

2.2 初始含水量的優(yōu)化

含水量是影響固態(tài)發(fā)酵的主要因素之一，從圖1可知，含水量為50%時(shí)色素的產(chǎn)量最高，可達(dá)0.93%。

圖1 初始含水量對色素產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of moisture content of beads on yieldof pigment

2.3 溫度的優(yōu)化

由圖2可知，培養(yǎng)溫度為30℃時(shí)，色素的產(chǎn)量最高，達(dá)1.09%。當(dāng)溫度低于28℃時(shí)，不僅最終的色素產(chǎn)量會(huì)下降，色素的合成時(shí)間也會(huì)推遲。 故選擇30℃為最佳培養(yǎng)溫度。

2.4 種齡的優(yōu)化

種齡對種子的活性和種子的濃度都有較大的影響。種齡過短，則大部分菌體尚處在適應(yīng)期，此時(shí)接種會(huì)延長前期菌體的生長時(shí)間；種齡過長，則菌體開始進(jìn)入衰亡階段，種子的活力也會(huì)急速下降，影響后期的發(fā)酵。由圖3可知，當(dāng)種齡為24 h時(shí)，色素的產(chǎn)量最高，達(dá)到1.44%。種齡超過24 h，色素的產(chǎn)量會(huì)迅速下降。

圖2 溫度對色素產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of temperature on yield of pigment

圖3 種齡對色素產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of seed age on yield of pigment

2.5 接種量的優(yōu)化

合適的接種量能縮短發(fā)酵周期，提高色素的產(chǎn)量。由圖4可知，當(dāng)接種量達(dá)到2 mL/30 g干重時(shí)，色素的產(chǎn)量達(dá)到1.66%。接種量繼續(xù)提高，色素的產(chǎn)量會(huì)出現(xiàn)下降的趨勢，因此選擇2 mL/30 g干重為最佳的接種量。

圖4 接種量對色素產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of inoculation amount of beads on yield of pigment

2.6 外加碳源、氮源及無機(jī)鹽的優(yōu)化

以葡萄糖為外加碳源，NH4Cl為外加氮源，CuSO4、MgSO4、CaCl2、KH2PO3、K2HPO4為 無 機(jī) 鹽 ， 按照表2設(shè)計(jì)7因素三水平正交實(shí)驗(yàn)，以確定各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)及配比，結(jié)果見表3～4。

表3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及結(jié)果Table 3 Data and results of orthogonal experiment

表4 方差分析Table 4 Tests of Between-Subjects Effects

表3表明，在各因素中，CaCl2的極差最大，其次 是 Glucose，KH2PO4，K2HPO4和 CuSO4，MgSO4； 而NH4Cl的極差最小。因此各因素的主次順序?yàn)?CaCl2＞Glucose ＞KH2PO4＞CuSO4＞K2HPO4＞MgSO4＞NH4Cl。最佳的碳氮源及無機(jī)鹽配比為:Glucose 5%，NH4Cl 1% ，CuSO40.05% ，CaCl20.10% ，KH2PO40.05%，K2HPO40.10%，MgSO40.20%。

表 4 方 差 分 析 表 明 ，Glucose，CuSO4，CaCl2，KH2PO4以及K2HPO4等五個(gè)因素在95%的置信度下對色素產(chǎn)量的影響都是顯著的。

3 結(jié)語

作者通過對竹黃菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)竹紅菌素條件的研究，確定了適宜的培養(yǎng)基的成分和培養(yǎng)條件。最佳培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件為:玉米顆粒度0.78～0.95 mm，麥秸添加量 10%，Glucose 5%，NH4Cl 1%，CuSO40.05%，CaCl20.10%，KH2PO40.05%，K2HPO40.10%，MgSO40.20%，初始含水量50%，培養(yǎng)溫度30℃，種齡24 h，接種量2 mL/30 g干重，優(yōu)化后竹紅菌素產(chǎn)量達(dá)1.66%（占培養(yǎng)基干重）。在本實(shí)驗(yàn)中，發(fā)酵周期長達(dá)15 d，因此，有必要對發(fā)酵條件和過程做進(jìn)一步優(yōu)化，以期縮短發(fā)酵時(shí)間。

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