基于抑制非酶糖基化效果的金耳液體發(fā)酵

鄭俊麗 ， 陶冠軍 ， 彭 林 ， 丁重陽(yáng) *， 顧正華 ， 張 梁 ， 石貴陽(yáng)

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122；2.糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇無(wú)錫214122；3.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122）

金耳（Tremella aurantialba）是一種重要的食藥用真菌，其子實(shí)體味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，金耳多糖作為金耳的有效化學(xué)物質(zhì)之一，具有降血糖[1]、抗腫瘤增強(qiáng)免疫[2]、抗氧化[3-4]等藥理作用。研究表明，金耳發(fā)酵液具有明顯的抑制非酶糖基化反應(yīng)的活性[5]。所謂非酶糖基化反應(yīng)，是指還原糖與體內(nèi)蛋白質(zhì)、氨基酸等的游離氨基端無(wú)需酶的催化，不可逆的以共價(jià)鍵結(jié)合形成結(jié)構(gòu)多樣的聚合物的過(guò)程。它是引起糖尿病腎病[6]、白內(nèi)障[7]和動(dòng)脈粥樣硬化[8]等并發(fā)癥的主要因素之一。

目前，關(guān)于金耳的研究主要集中在多糖的分離提取、生物活性以及以多糖產(chǎn)率為指標(biāo)的發(fā)酵條件優(yōu)化等方面。作者以抑制非酶糖基化反應(yīng)為指標(biāo)，研究了培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件對(duì)金耳發(fā)酵液抑制非酶糖基化反應(yīng)的影響，并以此優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件；同時(shí)初步分析了金耳發(fā)酵液中抑制非酶糖基化反應(yīng)的活性成分。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與設(shè)備

金耳（Tremella aurantialba）菌株:由江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室保存；葡萄糖、蛋白胨、牛血清白蛋白:均購(gòu)自國(guó)藥生化試劑有限公司；所用試劑均為分析純。

斜面培養(yǎng)基 （組分g/L）:馬鈴薯200，葡萄糖20，瓊脂條 20～22。

種子培養(yǎng)基（組分g/L）:葡萄糖20，玉米粉20，麩皮 10，KH2PO42，MgSO4·7H2O 1，VB1 15×10-3。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基（組分g/L）:葡萄糖20，麩皮10，KH2PO42，MgSO4·7H2O 1。

HITACHI 650-60熒光分光光度計(jì):株式會(huì)社日立制作所；回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖床:上海新星自動(dòng)化控制設(shè)備成套廠；DRP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱:上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；星海旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:無(wú)錫市星海王生化設(shè)備有限公司。

1.2 方法

在優(yōu)化碳源、氮源和復(fù)合營(yíng)養(yǎng)源時(shí)，以基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對(duì)照進(jìn)行優(yōu)化；在考察無(wú)機(jī)鹽對(duì)發(fā)酵的影響時(shí)，以不加KH2PO4和MgSO4·7H2O的的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為對(duì)照。

1.2.1 液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng) 在種子培養(yǎng)時(shí)，在250 mL三角瓶中加入80 mL種子培養(yǎng)基，滅菌后每瓶接入4塊0.5 cm2大小的活化菌種斜面，在25℃、150 r/min條件下培養(yǎng)144 h。在發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)，將液態(tài)種子以5%的接種體積分?jǐn)?shù)接種于裝有150 mL發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，在25℃、150 r/min條件下培養(yǎng)120 h。

1.2.2 碳源的優(yōu)化 實(shí)驗(yàn)中考察碳源為木糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、微晶纖維素和甘露醇，分別以2 g/L考察碳源代替發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的葡萄糖，對(duì)照組為發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基。發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液對(duì)非酶糖基化的抑制作用，每組設(shè)3個(gè)平行，取其平均值，根據(jù)抑制率確定最佳碳源。

1.2.3 氮源的優(yōu)化 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入5 g/L酵母膏，蛋白胨，酪蛋白，氯化銨，硫酸銨，尿素，確定最佳氮源。

1.2.4 復(fù)合營(yíng)養(yǎng)源的確定 用馬鈴薯和玉米粉分別代替發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的麩皮，另設(shè)不加任何復(fù)合營(yíng)養(yǎng)源作為空白對(duì)照考察復(fù)合營(yíng)養(yǎng)源對(duì)抑制非酶糖基化的影響，玉米粉和麩皮添加量10 g/L，馬鈴薯100 g/L，確定最佳復(fù)合營(yíng)養(yǎng)源。

1.2.5 無(wú)機(jī)鹽的優(yōu)化 在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加 入 0.5 g/L 的 FeSO4，ZnSO4，CuSO4，MnSO4，Cr2O3，CaCl2，CoCl2，KH2PO4，MgSO4·7H2O 和 Na2MoO4，以確定最佳無(wú)機(jī)鹽。

1.2.6 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選用葡萄糖，蛋白胨，玉米粉與麩皮為影響因素，設(shè)計(jì)四因素三水平（L9（34））正交試驗(yàn)。 基礎(chǔ)培養(yǎng)基為:0.5 g/L CoCl2，0.5 g/L MnSO4，裝液量 150 mL，接種體積分?jǐn)?shù)5%，溫度25℃，150 r/min培養(yǎng)120 h。按表1進(jìn)行正交試驗(yàn)，每組試驗(yàn)重復(fù)3次，測(cè)定發(fā)酵液對(duì)非酶糖基化反應(yīng)的抑制率，分析確定抑制率最高的培養(yǎng)基配比。

1.2.7 溫度和起始pH的優(yōu)化 金耳搖瓶試驗(yàn)分別在 20、25、28、30、37 ℃條件下進(jìn)行， 發(fā)酵結(jié)束后通過(guò)發(fā)酵液對(duì)非酶糖基化反應(yīng)的抑制率確定最適溫度。在確定最適溫度的基礎(chǔ)上，分別用2 mol/L HCl和NaOH調(diào)整發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的初始pH為3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、9.5，接種后培養(yǎng) 120 h，確定最佳pH。

表 1 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平Table 1 Orthogonal test of L9（34）

1.2.8 裝液量及接種體積分?jǐn)?shù)的優(yōu)化 500 mL三角瓶分別裝有 80、100、120、150、180 mL 發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，pH調(diào)節(jié)至1.2.4確定的最佳pH，在最適溫度下培養(yǎng)120 h，確定最佳裝液量。將種子分別以5%、10%、15%、20%的接種體積分?jǐn)?shù)接種到已確定的最佳裝液量的培養(yǎng)基中，在最佳初始pH、最適溫度下培養(yǎng)120 h后，測(cè)定發(fā)酵液對(duì)非酶糖基化反應(yīng)的抑制率，確定最佳接種體積分?jǐn)?shù)。

1.2.9 生物活性物質(zhì)的提取 在優(yōu)化培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下發(fā)酵得到的金耳發(fā)酵液，經(jīng)8 000 r/min離心10 min除去菌體，向離心得到的發(fā)酵液中加入體積分?jǐn)?shù)30%酒精，攪拌20 min后8 000 r/min離心5 min，除去蛋白質(zhì)，離心后的上清液繼續(xù)加入酒精至體積分?jǐn)?shù)70%，攪拌20 min后4℃冰箱靜置過(guò)夜。上清液除去酒精后，采用D101大孔樹(shù)脂脫色除雜得非多糖類粗品，4℃保存?zhèn)溆?。沉淀?5%工業(yè)酒精洗滌3次，60℃烘箱烘干，得多糖粗品。粗多糖上DEAE離子交換柱，經(jīng)蒸餾水洗脫后，用0～2 mol/L NaCl梯度洗脫，洗脫體積 300 mL，流速2 mL/min，自動(dòng)部分收集儀收集洗脫液，每管收集5 mL，苯酚-硫酸法檢測(cè)收集液吸光度，繪制洗脫曲線，并合并相應(yīng)洗脫峰部分，主要吸收峰樣品冷凍干燥用于活性分析。

1.2.10 體外抑制非酶糖基化反應(yīng)測(cè)定方法 所有搖瓶發(fā)酵液經(jīng)離心，上清液定容至原發(fā)酵液體積供分析測(cè)定。測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[9]進(jìn)行適當(dāng)修改，反應(yīng)體系包含12 mg/mL乙二醛，10 mg/mL牛血清白蛋白，2 mg/mL疊氮化鈉以及0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）。測(cè)定中1 mL樣品液和1 mL反應(yīng)液混合（對(duì)照組中由1 mL蒸餾水代替樣品液），混合液37℃反應(yīng)15～17 d后，在激發(fā)波長(zhǎng)370 nm，發(fā)射波長(zhǎng)440 nm波長(zhǎng)處測(cè)定熒光強(qiáng)度，重復(fù)三次，三次平均值計(jì)算抑制率。計(jì)算公式如下:

式中:I為抑制率；a為空白組熒光強(qiáng)度；b為樣品組熒光強(qiáng)度。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1 不同碳、氮源的確定 在真菌發(fā)酵過(guò)程中，培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件是影響真菌生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物合成的重要因素[10]。就發(fā)酵過(guò)程中所需碳氮源種類而言，不同菌株、不同目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)碳氮源的需求有明顯差別。王吉中等以產(chǎn)胞外多糖為目標(biāo)，確定了云芝液體發(fā)酵培養(yǎng)的最優(yōu)碳氮源分別為麥芽糖和多價(jià)胨[11]。劉艷芳[12]以生物量為主要指標(biāo)確定了雞腿蘑搖瓶培養(yǎng)的最佳碳源為玉米粉和蔗糖，氮源為麩皮。董昌金等發(fā)現(xiàn)利于金耳菌絲體生長(zhǎng)的最佳碳氮源分別為玉米粉和蛋白胨[13]。作者在考察碳源對(duì)抑制非酶糖基化反應(yīng)的作用中發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)中選用的不同碳源對(duì)于非酶糖基化的抑制作用影響較小，最高抑制率為對(duì)照組中選用的葡萄糖，抑制率達(dá)到52.81%，其他碳源均維持在40%左右（圖1a）。在考察的氮源中，發(fā)現(xiàn)無(wú)機(jī)氮源和有機(jī)氮源對(duì)非酶糖基化反應(yīng)的影響具有較大差別（圖1b）。添加無(wú)機(jī)氮源后，非酶糖基化反應(yīng)的抑制率對(duì)比未添加氮源有較大下降，而有機(jī)氮源則提升了金耳發(fā)酵液的抑制能力，其中蛋白胨的抑制率達(dá)到71.41%。通過(guò)碳源和氮源的優(yōu)化，分別選定葡萄糖和蛋白胨作為培養(yǎng)基的碳源和氮源。

圖1 不同碳氮源對(duì)非酶糖基化反應(yīng)抑制率的影響Fig.1 Effect of carbon and nitrogen resourceson inhibitory ratio of non-enzymatic glycosylation

2.1.2 不同復(fù)合營(yíng)養(yǎng)源的確定 在考察的三種復(fù)合營(yíng)養(yǎng)源中，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組麩皮的抑制率最高，其抑制率為52.81%，玉米粉（47.94%）的抑制率雖低于麩皮，但相比無(wú)任何復(fù)合營(yíng)養(yǎng)源組（18.31%），抑制率也有顯著提高，見(jiàn)圖2。因此選用麩皮和玉米粉作為復(fù)合營(yíng)養(yǎng)源。

圖2 不同復(fù)合營(yíng)養(yǎng)源及無(wú)機(jī)鹽對(duì)非酶糖基化反應(yīng)抑制率的影響Fig.2 Effect of nutrition compolex source on inhibitory ratio of non-enzymatic glycosylation

麩皮和玉米粉作為復(fù)合營(yíng)養(yǎng)源含有大量碳水化合物和多種維生素，為菌體生長(zhǎng)提供碳源的同時(shí)又作為復(fù)合維生素增加菌絲的懸浮性，促進(jìn)菌體生長(zhǎng)，利于代謝產(chǎn)物的合成[14]。

2.1.3 無(wú)機(jī)鹽的確定 添加CoCl2和MnSO4能稍許提高抑制率 （抑制率分別為54.52%和55.73%），KH2PO4和Na2MoO4與未加無(wú)機(jī)鹽相比抑制率基本一致，而添加其他無(wú)機(jī)鹽后抑制率均明顯降低，見(jiàn)圖3。說(shuō)明在金耳發(fā)酵培養(yǎng)基中添加無(wú)機(jī)鹽對(duì)非酶糖基化反應(yīng)抑制率沒(méi)有顯著增強(qiáng)作用。在以后試驗(yàn)中除補(bǔ)加CoCl2和MnSO4外不再補(bǔ)加其他無(wú)機(jī)鹽。

圖3 不同無(wú)機(jī)鹽對(duì)非酶糖基化反應(yīng)抑制率的影響Fig.3 Effect of inorganic salt on inhibitory ratio of nonenzymatic glycosylation

2.1.4 正交試驗(yàn)及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 金耳發(fā)酵培養(yǎng)基組分由正交試驗(yàn)優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)表2，試驗(yàn)結(jié)果顯示，蛋白胨質(zhì)量濃度極差最大，其次是玉米粉質(zhì)量濃度，由此得出蛋白胨質(zhì)量濃度對(duì)抑制率影響最大。結(jié)合均值分析后得出最佳培養(yǎng)基組成是A1B1C3D2，即最佳培養(yǎng)基組成為（g/L）:葡萄糖 10，蛋白胨 5，玉米粉 20，麩皮 15，CoCl20.5，MnSO40.5。在該條件下所得發(fā)酵液對(duì)非酶糖基化反應(yīng)的理論抑制率為74.89%。經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證在此培養(yǎng)基組成條件下培養(yǎng)，發(fā)酵液對(duì)非酶糖基化反應(yīng)的抑制率達(dá)75.82%，與理論值相符。

表2 優(yōu)化培養(yǎng)基成分L9（34）正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Orthogonal array design matrix and experimental results for optimizing fermentation medium

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 不同溫度及初始pH對(duì)非酶糖基化反應(yīng)抑制率的影響 通過(guò)考察溫度對(duì)抑制率的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在溫度為25℃時(shí)獲得最高抑制率75.93%，提高或降低培養(yǎng)溫度時(shí)會(huì)降低發(fā)酵液對(duì)非酶糖基化反應(yīng)的抑制率（圖4a）。初始pH對(duì)抑制非酶糖基化反應(yīng)的結(jié)果見(jiàn)圖4b。結(jié)果顯示，偏酸環(huán)境下發(fā)酵液對(duì)非酶糖基化的抑制作用較穩(wěn)定，當(dāng)pH小于6.5時(shí)，抑制率隨pH的升高而提高，pH 6.5左右時(shí)抑制率達(dá)到最大值82.20%；pH超過(guò)8.5時(shí)，抑制率呈明顯下降趨勢(shì)，當(dāng)pH為9.5時(shí)，抑制率僅為43.04%。通過(guò)對(duì)溫度及pH的優(yōu)化，分別選定25℃和pH 6.5為發(fā)酵溫度和培養(yǎng)基初始pH。

圖4 不同溫度及初始pH對(duì)非酶糖基化反應(yīng)抑制率的影響Fig.4 Effect of temperature and initial pH on inhibition ratio of non-enzymatic glycosylation

2.2.2 不同裝液量及接種量對(duì)非酶糖基化反應(yīng)抑制率的影響 裝液量主要通過(guò)溶氧影響菌體生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物的合成，進(jìn)而導(dǎo)致抑制率的變化。通過(guò)對(duì)裝液量的考察發(fā)現(xiàn)，500 mL三角瓶裝液量150 mL時(shí)抑制率最高，增加或減少裝液量時(shí)抑制率略有下降。因此，裝液量對(duì)抑制率的影響較?。▓D5a），在以后實(shí)驗(yàn)中采用500 mL三角瓶裝液量150 mL。接種量的大小決定了菌種在發(fā)酵過(guò)程中的生長(zhǎng)速度，采用大接種量有利于縮短生長(zhǎng)延遲期，但過(guò)高的接種量使菌絲體迅速生長(zhǎng)，消耗大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，反而影響后期的生長(zhǎng)及代謝產(chǎn)物生成[15]。在考察接種量的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)接種量為10%時(shí)，抑制率最高（89.74%），接種量低于或高于10%時(shí)，抑制率均有所下降，尤其是接種量高于10%后，抑制率下降較明顯（圖5b）。所以在以后實(shí)驗(yàn)中采用10%的接種量。

圖5 不同裝液量及接種體積分?jǐn)?shù)對(duì)非酶糖基化反應(yīng)抑制率的影響Fig.5 Effect of different volume medium and inoculum size on inhibition ratio of non-enzymatic glycosylation

2.3 金耳活性物質(zhì)對(duì)非酶糖基化反應(yīng)的抑制作用

分別稱取多糖和非多糖類粗品240 mg，溶于6 mL去離子水中，待完全溶解后取3 mL做兩倍稀釋，依次稀釋7次，分別測(cè)定不同濃度梯度的粗提物對(duì)非酶糖基化反應(yīng)的抑制率，見(jiàn)圖6。

圖6 多糖和其他活性物質(zhì)對(duì)非酶糖基化反應(yīng)的抑制作用Fig.6 Effect of different concentration polysaccharides and non-polysaccharideson non-enzymatic glycosylation in vitro

結(jié)果顯示，多糖和非多糖類物質(zhì)對(duì)體外非酶糖基化反應(yīng)均有抑制作用，其中多糖類物質(zhì)對(duì)非酶糖基化抑制作用的半抑制率質(zhì)量濃度IC50為7.15mg/mL，而非多糖類物質(zhì)為4.26 mg/mL。這說(shuō)明在金耳發(fā)酵液中多糖和其它非多糖類物質(zhì)對(duì)抑制非酶糖基化反應(yīng)起共同抑制作用，并且以非多糖類物質(zhì)為主。

藥用真菌作為藥物資源豐富，目前已開(kāi)發(fā)的藥用真菌主要以多糖成分為主，而藥用真菌除含有多糖外還含有生物堿、甾醇類和萜類等化合物。研究表明，靈芝中萜類化合物活性高，可以降血糖，降低血壓，而樟芝對(duì)晚期癌癥有較好的療效主要也是萜類化合物起作用[16]。Kim等研究發(fā)現(xiàn)，姬松茸中的β-葡聚糖和寡糖均能使糖尿病小鼠的血糖水平顯著下降，其中寡糖的功效最為明顯[17]。目前為止，關(guān)于金耳代謝物的研究，張志才曾報(bào)道了金耳粗提物（TBE，非多糖類小相對(duì)分子質(zhì)量物質(zhì)，具體結(jié)構(gòu)尚不清楚。）對(duì)非酶糖基化反應(yīng)有抑制作用[18]；有研究者從金耳子實(shí)體中分離出一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu) （金耳素）[19]，關(guān)于其抑制非酶糖基化方面的生物學(xué)功能還沒(méi)有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)金耳多糖和非多糖類物質(zhì)對(duì)非酶糖基化反應(yīng)均有抑制作用。金耳多糖的研究主要集中在降血糖，降血脂，抗氧化等方面，其抑制非酶糖基化方面卻鮮有報(bào)道。非多糖類粗品中具有抑制非酶糖基化作用的物質(zhì)可能也是某種寡糖或萜類物質(zhì)。

3 結(jié)語(yǔ)

作者以抑制非酶糖基化為檢測(cè)平臺(tái)，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)，確定了培養(yǎng)基成分:葡萄糖10 g/L，蛋白胨 5 g/L，玉米粉 20 g/L，麩皮 15 g/L，CoCl20.5 g/L，MnSO40.5 g/L。在優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上通過(guò)單因素試驗(yàn)得出最佳培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度25℃，初始pH 6.5，500 mL三角瓶裝液量150 mL，接種體積分?jǐn)?shù)10%，優(yōu)化后的抑制率達(dá)89.74%，是基礎(chǔ)培養(yǎng)基的1.7倍。

通過(guò)對(duì)金耳發(fā)酵液抑制非酶糖基化的物質(zhì)的初步分析，發(fā)現(xiàn)除多糖外可能還含有某種寡糖或萜類物質(zhì)具有抑制非酶糖基化的作用，具體的化學(xué)結(jié)構(gòu)正在進(jìn)一步研究中。

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