手工制作組織芯片及體會

李學(xué)禮 潘云

組織芯片（tissue chip），也稱組織微陣列（tissue microarrays），是生物芯片技術(shù)的一個重要分支，是將許多不同個體組織標(biāo)本以規(guī)則陣列方式排布于同一載玻片上，進(jìn)行同一指標(biāo)的原位組織學(xué)研究。該技術(shù)自1998年[1]問世以來，因其具有高信息量、高效、節(jié)省檢測試劑、減少實驗誤差、增加可比性、易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點，且其制備技術(shù)簡單[2]，容易掌控，得到大范圍的推廣應(yīng)用。

為此本文參照部分文獻(xiàn)自行手工方法制作組織芯片，取得了比較滿意的效果，現(xiàn)制作過程和經(jīng)驗體會簡短介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料 套管打孔針，采用北京博康實驗儀器有限公司生產(chǎn)的組織芯片制備儀所佩帶直徑2 mm套針。

1.1.1 石蠟采用國產(chǎn)的熔點為58～60℃醫(yī)用石蠟

1.1.2 主要的實驗儀器及設(shè)備 自制石蠟包埋用鉛模；恒溫恒濕箱（上海博訊是也有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；萊卡全自動石蠟切片機（德國）；萊卡DM3000多頭顯微鏡（德國萊卡公司）。

1.1.3 實驗用病理標(biāo)本為大理學(xué)院附屬醫(yī)院病理科2012 年

1 -5 月乳腺癌手術(shù)切除的病理乳腺癌標(biāo)本

1.2 方法

1.2.1 制作前石蠟 石蠟在65～67 ℃條件下熔化并放65恒溫恒濕箱中保持熔化狀態(tài)下備用。

1.2.2 供體標(biāo)本的準(zhǔn)備及篩片 實驗用供體蠟塊為病理科常規(guī)蠟塊標(biāo)本，調(diào)取其對應(yīng)HE 染色玻片，經(jīng)有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師顯微鏡閱片后選取病變典型部位并在供體蠟塊上作好相應(yīng)標(biāo)記備用

1.2.3 組織芯片制作方法 用自制鉛模為蠟塊模具制作厚約8 mm，大小2 cm×2.5 cm的受體蠟塊，并將其置于40 ℃恒溫臺上用打孔套針打孔，在受體蠟塊上構(gòu)建3×4個點陣，孔間距為3 mm。用打孔套針在供體蠟塊所做標(biāo)記處抽取組織芯條，放入受體蠟?zāi)？變?nèi)。并用套針（帶套芯）壓實組織芯條。將受體蠟?zāi)＃ㄒ讶胄緱l）連同鉛模放入60℃恒溫恒濕烤箱中40 min，使組織芯條與芯孔周邊蠟體緊密融合，將受體蠟塊（帶鉛模）進(jìn)行二次包埋，包埋后立刻放入60 ℃恒溫恒濕烤箱中20 min，進(jìn)行再次充分融合，取出受體蠟塊冷卻，即可制成組織芯片蠟塊備用。

1.2.4 切片 冰組織芯片蠟塊好后以4 μm厚連續(xù)切片，裱貼于準(zhǔn)備好的載玻片上。微陣列蠟塊的切片由經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師在德國徠卡切片機上進(jìn)行切片；其過程與常規(guī)組織切片相同，但因為蠟塊內(nèi)的組織芯條較多，裱片時操作要輕、穩(wěn)，速度適宜，避免組織切片的離斷或芯片內(nèi)芯點陣列的偏移。共制作蠟塊4個，各切片2 張共8張切片。放在70 ℃烤片機上烘烤20 min，完成組織芯片的制作。

2 結(jié)果

制作3×4組織芯片共8張，HE染色后芯片無脫片、倒浮現(xiàn)象，各芯點完整，僅伴有輕度點陣移位現(xiàn)象。

3 討論

組織芯片技術(shù)是生物芯片技術(shù)的一個重要分支，首先是Battifora[3]在1986 年提出來的，直到1998年，由Kononen 等[1]提出了組織芯片的明確概念，于是一種新的大樣本，高通量的快速分析工具在醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)領(lǐng)域得到迅速的發(fā)展，該技術(shù)有諸多優(yōu)點，如高信息量、高效、節(jié)省檢測試劑、減少實驗誤差、增加可比性、易于標(biāo)準(zhǔn)化，且其制備技術(shù)簡單，易掌控。組織芯片結(jié)合傳統(tǒng)病理學(xué)技術(shù)、免疫組織化學(xué)（IHC），原位雜交（ISH）及熒光原位雜交（FISH）等分子生物學(xué)技術(shù)[4-5]，可以廣泛地運用于生命科學(xué)研究等諸多領(lǐng)域。

3.1 供體蠟塊的篩選 選取病理科供體蠟塊及相對的切片，首先由經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)生進(jìn)行切片的篩片，準(zhǔn)確的找出病變明顯的區(qū)域并相應(yīng)的作出標(biāo)記，注意標(biāo)記的直徑小于3 mm，從而盡量避免因標(biāo)記區(qū)域過大而出現(xiàn)無效組織。因部分蠟塊經(jīng)反復(fù)使用，內(nèi)部組織厚薄不已，所取組織芯條易出現(xiàn)長短不一或不含所需組織，所以盡量選取組織塊較厚的蠟塊，以提高制備的組織芯片的利用率。

3.2 受體蠟塊的制備 打孔時，若空白受體蠟塊溫度過高，不易成形，溫度過低，易將蠟?zāi)４蛄?，產(chǎn)生廢模[6-7]，經(jīng)多次實驗，將制好的空白蠟塊置于50℃的恒溫箱中20 min，取出置于40～50 ℃操作臺上迅速打孔，打孔時，避免用力擠壓蠟?zāi)Ｖ滦究资軌嚎s小。

3.3 組織芯條的鉆取 鉆取組織芯條的過程中，首先將供體蠟塊置于45 ℃的恒溫箱中10 min，取出置于40～50 ℃操作臺上迅速鉆取組織芯條，鉆取中應(yīng)垂直進(jìn)針，均勻用力，防止損傷供體蠟塊。

3.4 組織芯片蠟塊的二次包埋 將組織芯條按順序置入受體蠟塊后，并用套針（帶套芯）壓實組織芯條，使芯條在同一平面上，然后進(jìn)行受體蠟塊的二次包埋，包埋采用熔化石蠟普通灌注的方法[8]，具體過程是，首先將供體蠟塊（已塞入芯條）連同鉛摸一起置于60 ℃烤箱內(nèi)1 h，然后取出注入熔化石蠟，再將蠟?zāi)Ｍ瀴K置于60 ℃烤箱內(nèi)30 min，再次進(jìn)行重新熔合，石蠟組織芯與空心蠟?zāi)？妆陂g存在微小間隙，熔化的石蠟接觸蠟?zāi)r，未充分填充微小間隙便開始凝固，從而使二次包埋失敗。先將其置入60 ℃烤箱內(nèi)1 h，主要目的是使兩者重新熔為一體，從而達(dá)到目的[8-10]。二次包埋成功的組織芯片蠟塊，應(yīng)具備以下特點：（1）組織芯片蠟塊中的組織芯條排列整齊，無倒浮、移位現(xiàn)象；（2）蠟塊中組織芯條所含的目標(biāo)組織處于同一平面上，便于統(tǒng)一切片；（3）石蠟組織芯條與空心蠟?zāi)ｉg空隙填充良好，并充分熔合，所制備組織芯片中的微組織塊無脫片、皺褶現(xiàn)象。

3.5 組織芯片的切片 為保證蠟塊微組織的完整性，每塊組織芯片蠟塊需多切片；漂片時水溫要適宜，若溫度過高組織片所含的微組織易發(fā)生離散，溫度過低則難以保證其充分展開。

3.6 組織芯片技術(shù)的應(yīng)用 組織芯片的應(yīng)用領(lǐng)域正在不斷的拓展，可用于免疫組織化學(xué)（IHC），原位雜交（ISH）及熒光原位雜交（FISH）等原位組織檢測技術(shù)。

3.7 組織芯片的敏感性和準(zhǔn)確性 Garcia 等[11]研究證實組織芯片技術(shù)與傳統(tǒng)制片方法具有相同的敏感性和準(zhǔn)確性， 組織芯片技術(shù)可以替代傳統(tǒng)制片技術(shù)。但是，有些學(xué)者發(fā)現(xiàn)組織芯片技術(shù)仍存在一定的偏倚[12]。為反映原組織結(jié)構(gòu)的信息，本實驗所采取的組織樣本是直徑2 mm。

3.8 組織芯片的缺點 織芯片也存在其不足的以下幾個方面，如組織取材相對較少，所取位點的微組織并不一定能完全反應(yīng)腫瘤的全貌，切片微組織易移位、脫落，從而給結(jié)果的判定帶來誤差。

組織芯片技術(shù)具有高信息量、高效、低消耗、自身內(nèi)對照和易于標(biāo)準(zhǔn)化等諸多優(yōu)點，且其制備技術(shù)簡便、易行、經(jīng)濟實用。 組織芯片技術(shù)還可以與免疫組織化學(xué)、核酸原位雜交、熒光原位雜交、原位PCR等諸多常規(guī)技術(shù)相結(jié)合應(yīng)用，它的應(yīng)用領(lǐng)域正在不斷地拓展。

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