基質(zhì)金屬蛋白酶-9基因單核苷酸多態(tài)性與冠心病遺傳易感性的關(guān)系研究

楊 耀 孫 翔 朱志軍 張迎軍

1.解放軍第一一七醫(yī)院心血管中心，浙江杭州 310000；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院心內(nèi)科，內(nèi)蒙古呼和浩特 010058

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）是對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)成分（extracellular matrix，EMC）有特異降解作用的鋅依賴蛋白水解酶，在人體內(nèi)主要作用是參與細(xì)胞外基質(zhì)成分的降解、重構(gòu)、炎性反應(yīng)等各種生理及病理過(guò)程[1-3]?；|(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）又稱為明膠酶B，是基質(zhì)金屬蛋白酶家族之一，具有降解血管壁細(xì)胞外基質(zhì)中成分的功能，影響動(dòng)脈斑塊的穩(wěn)定性，與冠心病的發(fā)病具有一定關(guān)聯(lián)性，目前已發(fā)現(xiàn)MMP-9基因中存在著多個(gè)序列變異，其中，啟動(dòng)子序列-1562C/T多態(tài)位點(diǎn)最受到關(guān)注。-1562C/T多態(tài)位點(diǎn)與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary disease，CAD）易感性關(guān)系的研究結(jié)果眾說(shuō)紛紜[4]。為此，本研究通過(guò)采用限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng) （PCRRFLP），了解MMP-9-1562C/T基因多態(tài)性的分布，計(jì)算各SNP位點(diǎn)的等位基因頻率、基因型頻率，從而分析MMP-9-1562C/T基因多態(tài)性與CAD易感性的相關(guān)性，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用隨機(jī)數(shù)字表法抽取2010年1月～2012年10月于解放軍第一一七醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）心內(nèi)科就診的冠心病患者240例作為病例組，其中，穩(wěn)定型心絞痛（atable angina，SA）84 例，不穩(wěn)定型心絞痛（unstable angina，UA）90例，急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）66 例。病例的診斷及分型參照1997年WHO的診斷標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)隨機(jī)抽取同期至我院其他科室就診的患者200例作為對(duì)照組，患者冠狀動(dòng)脈造影結(jié)果均正常，未患有心臟相關(guān)疾病，無(wú)冠心病史。病例及對(duì)照組均排除患有惡性腫瘤、免疫系統(tǒng)疾病、感染性疾病、外周血管疾病、嚴(yán)重肝腎功能不全及使用免疫抑制劑者。兩組平均年齡、性別構(gòu)成等一般情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。見表1。所有入組調(diào)查對(duì)象間均無(wú)血緣關(guān)系，并且均簽署知情同意書。所有實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范及樣本采集方式均經(jīng)我院倫理委員會(huì)倫理會(huì)議通過(guò)。

表1 調(diào)查對(duì)象一般資料比較（ ±s）

表1 調(diào)查對(duì)象一般資料比較（ ±s）

注：1 mm Hg=0.133 kPa；BMI：體重指數(shù)；SBP：收縮壓；DBP：舒張壓；Glu：血糖；TG：三酰甘油；TC：總膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDLC：低密度脂蛋白膽固醇

病例組對(duì)照組t/χ2值P值61.6±11.7 61.9±10.6 1.285＞0.05 159/81 126/74 1.006＞0.05 24.0±3.0 23.1±2.5 1.320＞0.05 129.7±15.3 127.6±14.4 0.745＞0.05 80.9±11.7 78.5±8.8 0.584＞0.05 4.9±1.4 4.9±1.3 0.412＞0.05 1.7±0.6 1.6±0.6 0.303＞0.05組別 年齡（歲）性別（例，男/女）BMI（kg/m2）SBP（mm Hg）DBP（mm Hg）Glu（mmol/L）TG（mmol/L）4.7±1.7 4.7±1.2 0.314＞0.05 1.0±0.2 1.0±0.3 0.257＞0.05 3.1±1.1 3.2±0.4 0.679＞0.05 TC（mmol/L）HDL-C（mmol/L）LDL-C（mmol/L）

1.2 方法

1.2.1 試劑和儀器 SphⅠ限制性內(nèi)切酶由伊普瑞斯科技有限公司提供，紫外分光光度計(jì)、PCR儀由上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠提供。

1.2.2 資料收集及常規(guī)檢測(cè) 收集病例組及對(duì)照組的一般人口學(xué)特征（年齡、性別）、家族史、冠心病史、冠心病危險(xiǎn)因素暴露情況（高血壓、糖尿病、高脂血癥等），對(duì)調(diào)查對(duì)象進(jìn)行血壓、血糖、血脂等常規(guī)檢測(cè)。

1.2.3 PCR檢測(cè) 采用PCR-RFLR法對(duì)調(diào)查對(duì)象血液樣本進(jìn)行基因分型，并對(duì)比病例組及對(duì)照組之間的差異。人類MMP-9 基因（ID：4318）位于 20q11.2～q13.1，長(zhǎng) 7654 bp，mRNA長(zhǎng)2387 bp，編碼 13個(gè)外顯子，該基因共 155個(gè)單核苷酸多態(tài)性 （SNPs），本次研究選擇位于啟動(dòng)子區(qū)的-1562C/T作為研究位點(diǎn)。采用鹽析法提取調(diào)查對(duì)象外周血基因組DNA，對(duì)提取的DNA進(jìn)行鑒定，若DNA的OD260/OD280＞1.7，說(shuō)明DNA純度合格，否則需從新提取。將鑒定合格的DNA進(jìn)行定量，根據(jù)測(cè)定原液的DNA濃度加入TE液，將DNA的終濃度稀釋為20 ng/μL。建立PCR反應(yīng)體系 10 μL及酶切體系15 μL，PCR的反應(yīng)條件如下：95°C 5 min；95°C 30 s，69°C 30 s，72°C 40 s，35 個(gè)循環(huán)；72°C 7 min， 產(chǎn)物為 435 bp。 引物序列為 （U）5'-CCTGCTA CAATATACCCCC-3'， （L）5'-CTTCTCTAGCCTCAGGGCATC-3'。內(nèi)切酶酶切片段長(zhǎng)度C等位基因?yàn)?35 bp，T等位基因?yàn)?47 bp+188 bp。當(dāng)-1562C/T多態(tài)性為C等位基因時(shí)，PCR產(chǎn)物不能被SphⅠ內(nèi)切酶識(shí)別，反應(yīng)后MMP-9-1562C/T為CC純合子基因型的個(gè)體片段長(zhǎng)度為僅一個(gè)片段，為435 bp；MMP-9-1562C/T多態(tài)性為T等位基因時(shí)，PCR產(chǎn)物可被SphⅠ識(shí)別，因此，MMP-9-1562C/T為TT純合子基因型個(gè)體經(jīng)限制性內(nèi)切酶SphⅠ酶切后產(chǎn)生兩個(gè)片段，分別為247 bp和188 bp；MMP-9-1562C/T為CT雜合子基因型個(gè)體的PCR產(chǎn)物經(jīng)SphⅠ酶切后產(chǎn)生3個(gè)片段，分別為435 bp、247 bp和188 bp。采用瓊脂糖凝膠電泳法鑒定樣本的基因型，凝膠成像結(jié)果膠片拍照保存并由兩名醫(yī)師獨(dú)立判斷結(jié)果，核實(shí)后錄入數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

病例組 MMP-9-1562C/T基因型為 CC、CT、TT的頻率分別為 0.78、0.20、0.02， 對(duì)照組分別為 0.81、0.18、0.01，兩組基因型的分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.59，P＞0.05）；病例組與對(duì)照組CC/CT+TT的OR值為0.83，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OR 95%CI：0.51～1.36，P>0.05），見表 2。 病例組與對(duì)照組C/T等位基因OR值為0.83，差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OR 95%CI：0.44～1.55，P ＞ 0.05），見表 3。 提示 MMP-9-1562C/T基因型及等位基因與冠心病的發(fā)生無(wú)關(guān)聯(lián)性。

表2 兩組MMP-9-1562C/T基因型頻率情況

表3 兩組MMP-9-1562C/T等位基因頻率情況

3 討論

目前越來(lái)越多的研究證實(shí)MMPs啟動(dòng)子區(qū)域的SNPs影響著MMPs的轉(zhuǎn)錄活動(dòng)，MMPs活性增強(qiáng)時(shí)[5-7]，會(huì)引起動(dòng)脈中膠原成分的減少，使冠狀動(dòng)脈中斑塊結(jié)構(gòu)脆化，纖維帽易于破裂，從而引起冠心病的發(fā)生。MMP-9是MMPs中重要的一員，能夠廣泛降解明膠、膠原及彈性蛋白。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)建立了敲除MMP-9基因的小鼠模型[8]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，敲除模型小鼠比野生小鼠更不容易發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化病變。因此，認(rèn)為高度表達(dá)的MMP-9基因與冠脈粥樣硬化、冠狀動(dòng)脈斑塊不穩(wěn)定、支架內(nèi)再狹窄等有關(guān)。人類MMP-9基因（ID：4318）位于 20q11.2～q13.1，共 155 個(gè) SNPs，其中，位于啟動(dòng)子區(qū)的-1562C/T與冠心病發(fā)生的關(guān)聯(lián)性較受關(guān)注。既往研究認(rèn)為，-1562C/T多態(tài)性位點(diǎn)的堿基突變能夠在轉(zhuǎn)錄水平影響基因表達(dá)，從而影響酶蛋白合成數(shù)量。當(dāng)突變位點(diǎn)位于該基因與轉(zhuǎn)錄抑制蛋白結(jié)合的區(qū)域內(nèi)，C堿基突變?yōu)門堿基后，區(qū)域的構(gòu)型即可發(fā)生變化，導(dǎo)致基因與轉(zhuǎn)錄抑制蛋白的結(jié)合力下降，轉(zhuǎn)錄抑制的作用減弱，啟動(dòng)子活性增強(qiáng)，基因轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)，MMP-9表達(dá)量增加，MMP-9對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解增加，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈破壞增加。

然而，目前關(guān)于MMP-9-1562C/T與冠心病發(fā)生關(guān)聯(lián)性的報(bào)道結(jié)論不一致[9-12]。有文獻(xiàn)證實(shí)了，-1562C＞T基因多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈狹窄程度具有相關(guān)性，冠心病患者中CT和TT兩種基因型的分布頻率明顯高于冠狀動(dòng)脈造影正常者；經(jīng)過(guò)Logistic回歸分析后發(fā)現(xiàn)，T等位基因攜帶者發(fā)生冠心病的風(fēng)險(xiǎn)比未攜帶該等位基因者高1.5倍[9-10]。而Wang等[11]報(bào)道，-1562C/T多態(tài)性與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化程度無(wú)關(guān)。Haberbosch等[12]通過(guò)設(shè)計(jì)病例對(duì)照研究在德國(guó)人群中研究的結(jié)果認(rèn)為，MMP-9基因-1562C＞T多態(tài)性與冠心病的發(fā)病及心肌梗死的發(fā)生無(wú)相關(guān)。本次研究結(jié)果也顯示，MMP-有1只于術(shù)后第9天死于肺炎。Fandrich等[7]也發(fā)現(xiàn)，有2只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物因分泌的黏液積聚在移植物的遠(yuǎn)端而致肺水腫和肺不張。而Letang等[5]應(yīng)用紗布擦去小腸的黏膜層后未發(fā)現(xiàn)大量黏液分泌的現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也支持該結(jié)果。A組（不去空腸黏膜組）發(fā)現(xiàn)氣管造瘺口術(shù)后 1周內(nèi)有較多腸液流出，有2只Beagle犬在術(shù)后第2周因肺部感染死亡，而B、C組（部分及全部去空腸黏膜組）術(shù)后1周內(nèi)則有較少腸液流出，咳嗽較輕。然而，過(guò)度搔刮全部去除黏膜層，亦會(huì)造成術(shù)后肉芽生長(zhǎng)，上皮生長(zhǎng)延遲，因缺乏上皮的覆蓋，會(huì)減弱動(dòng)物抵抗病原體感染的能力。本實(shí)驗(yàn)中全部去除黏膜層組有1只Beagle犬在術(shù)后第50天因移植空腸感染而死亡，估計(jì)與上述因素有關(guān)。

化生是機(jī)體的一種組織因細(xì)胞生活環(huán)境改變或理化因素刺激，在形態(tài)和機(jī)能上變?yōu)榱硪环N組織的過(guò)程，是機(jī)體的一種適應(yīng)現(xiàn)象。正常氣管的內(nèi)壁為假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮覆蓋，黏液-纖毛轉(zhuǎn)用系統(tǒng)在氣道防御機(jī)制中占有重要地位，是氣道的第一道防線。而空腸內(nèi)腔為單層柱狀上皮，有大量小腸腺和絨毛結(jié)構(gòu)，不存在黏液-纖毛轉(zhuǎn)用系統(tǒng)。因此，移植空腸的黏膜上皮完全化生為假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮，并具有正常的纖毛功能，這是最為理想的氣管重建。Letang等[5]擦除了空腸黏膜行腸代氣管重建的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，術(shù)后在吻合口附近的空腸腔內(nèi)有少量的鱗狀上皮出現(xiàn)，術(shù)后3周有近20%的空腸表面被鱗狀上皮覆蓋，認(rèn)為這些鱗狀上皮可能起源于附近的正常氣管的上皮。Nakayama[6]的研究也觀察到類似的現(xiàn)象。本研究在空腸重建氣管缺損動(dòng)物模型的腸膜黏組織變化的研究過(guò)程中，也觀察到了這一現(xiàn)象：A、B、C三組均在術(shù)后6個(gè)月，在移植空腸表面見假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮覆蓋，B、C組較A組 早1個(gè)月出現(xiàn)假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，去部分空腸黏膜能加速移植空腸的上皮化，加速纖毛柱狀上皮的化生，但對(duì)空腸黏膜的最終化生結(jié)果沒有影響。

本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，去除部分腸黏膜能有效減少分泌細(xì)胞的數(shù)量，從而減少移植空腸的腸液分泌，減少分泌物對(duì)呼吸系統(tǒng)的影響；去部分腸黏膜能加速空腸黏膜萎縮變薄、絨毛變短脫落[8-9]，促進(jìn)鱗狀上皮化生，減少因缺乏上皮的覆蓋，導(dǎo)致病原體的感染，從而促進(jìn)氣管愈合。據(jù)此，去部分腸黏膜游離空腸重建氣管動(dòng)物模型是一較為理想的游離空腸重建氣管動(dòng)物模型，其將有望解決空腸移植術(shù)后腺體分泌及上皮覆蓋這兩大難題，使游離空腸重建氣管技術(shù)更接近理想，為游離空腸重建氣管應(yīng)用于臨床提供良好的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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