牛奶中乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)及鑒定

崔新潔 王婷 劉秉春 陶林 王瀟

（內(nèi)蒙古大學生命科學學院，呼和浩特 010010）

在奶牛乳腺炎的發(fā)病過程中，乳腺上皮細胞是與外界直接相通的細胞，乳腺上皮細胞上含有模式識別受體TLR，對機體的先天性免疫具有重要的作用。除此之外，乳腺上皮細胞最重要的功能是泌乳。因此建立簡便、經(jīng)濟、純凈的乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)模型，對病原免疫學以及泌乳機制的研究都具有重要的意義。1961年，Ebner等［1］第一次將乳腺上皮細胞在體外培養(yǎng)至30-40代，但是，隨著傳代次數(shù)的增加，大多數(shù)上皮細胞失去原有的特性，而表現(xiàn)成纖維細胞的特性。之后多種方法被采用，以去除成纖維細胞的污染，如在培養(yǎng)液中添加D-纈氨酸以選擇性地去除成纖維細胞，或密度梯度離心法，或膠原酶與胰酶共同消化法等［2-10］，但隨著傳代的進行，都不同程度地混有成纖維細胞的污染。乳汁是由乳腺上皮細胞分泌的，在分泌乳汁的過程中，會有很多乳腺上皮細胞自然脫落，隨乳汁分泌到體外，因此從乳汁中可以分離培養(yǎng)乳腺上皮細胞，同時，分離到的細胞中不含有成纖維細胞的污染，克服了組織塊消化法的缺點，另外，該種方法無需使用昂貴的膠原酶，較組織塊消化法更為經(jīng)濟。國外研究人員已利用該法成功培養(yǎng)出了乳腺上皮細胞［11，12］，主要是通過離心新鮮牛奶收集牛奶中細胞的方法來培養(yǎng)乳腺上皮細胞，目前在國內(nèi)報道中，通過乳汁分離法獲得乳腺上皮細胞的不多，只有崔立莉［13］成功從牛奶中分離培養(yǎng)了乳腺上皮細胞。牛乳腺上皮細胞是高度分化的細胞，在體外培養(yǎng)時培養(yǎng)基的成分是培養(yǎng)成功的關(guān)鍵。早期的研究者已經(jīng)證實激素對乳腺上皮細胞的生長是有利的，Turkington［14］研究發(fā)現(xiàn)牛胰島素、氫化考的松、催乳素等激素的相互作用會促進乳腺細胞中RNA的生物合成；另外，Turkington還發(fā)現(xiàn)EGF，即上皮細胞生長因子可以促進乳腺上皮細胞中DNA的合成及隨后的細胞分裂［15］。因此，在培養(yǎng)細胞的過程中，通常將激素、EGF和谷氨酸作為上皮細胞培養(yǎng)基中主要的成分［16-19］。綜合前人的研究，本研究采用新鮮牛奶作為試驗材料，擬建立一種較成熟、簡單的乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)方法，旨在為體外試驗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2011年7月至12月，在內(nèi)蒙古大學完成。新鮮牛奶取自內(nèi)蒙古呼和浩特市小黑河鎮(zhèn)二道河村奶農(nóng)飼養(yǎng)的日產(chǎn)奶量25-40 kg的高產(chǎn)荷斯坦奶牛。

試驗過程中使用的儀器包括超凈工作臺、離心機、CO2培養(yǎng)箱、熒光倒置顯微鏡、普通光學顯微鏡以及PCR儀等。完全培養(yǎng)液成分是10% FBS+DMEM/F12+100 U雙抗+氫化考的松（1 μg/mL）+孕酮（1 μg/mL）+轉(zhuǎn)鐵蛋白（5 μg/mL）+胰島素（5μg/mL）+200 mmol L-谷氨酰胺+10 ng/mL EGF；其中FBS和DMEM/F-12購自Hyclone公司，EGF購自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司，其余添加因子購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 乳汁中分離培養(yǎng)細胞 用無菌水清洗牛乳房，酒精消毒，手擠牛乳于滅菌的藍蓋瓶中，放于盛有37℃水的保溫盒中帶回實驗室。將200 mL乳汁與含雙抗的PBS按2∶1混合后，轉(zhuǎn)入15 mL離心管中，1 500 r/min，離心20 min，離心后分3層，棄掉乳脂層及大部分乳白色渾濁層至剩余1 mL左右，混合所有離心管中剩余的液體（切勿吸取底層白色沉淀）于一離心管中，再次離心15 min后，小心棄掉上層乳白色液體后，剩余0.5 mL細胞層，將剩余細胞層轉(zhuǎn)移到5 mL完全培養(yǎng)液中（切勿吸取底層白色沉淀），接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，5%CO2箱中培養(yǎng)，每隔2 d換液，待細胞長出單克隆后原瓶消化，待長至80%匯集時，傳代培養(yǎng)（1傳3），多次傳代后凍存。

1.2.2 MTT法測定細胞生長曲線 細胞復(fù)蘇，用臺盼藍染色確定濃度，接種于96孔細胞培養(yǎng)板。細胞接種濃度為4×103個/孔，設(shè)置對照組和試驗組，每組3個重復(fù)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1、2、3、4、5、6、7 d后于同一時間吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，分別加入MTT使用液（100 μL孔，濃度0.5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入DMSO液（150 μL/孔），37℃下培養(yǎng)箱中孵育10 min，不斷震蕩使結(jié)晶物溶解。酶標儀檢測各孔OD570nm值。記錄結(jié)果，繪制細胞活力曲線圖。

1.2.3 RT-PCR檢測角蛋白8、18及β-酪蛋白 細胞復(fù)蘇，生長到80%匯合時，胰酶消化，收集細胞，用總RNA提取試劑盒（TaKaRa；D9108A）抽提細胞總RNA。為排除基因組DNA的污染，用DNA酶（TaKaRa；00079459）消化處理后，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa；BK3702）反轉(zhuǎn)錄，用PCR反應(yīng)試劑盒（TaKaRa；DR100A）進行擴增反應(yīng)，電泳檢測擴增產(chǎn)物。退火溫度分別是角蛋白8：62℃；角蛋白18：62℃；β-酪蛋白：62℃ 。

根據(jù)NCBI上公布的牛基因序列設(shè)計引物如表1所示。

1.2.4 細胞免疫熒光染色法鑒定角蛋白8 細胞復(fù)蘇，于常溫下用4%的多聚甲醛固定30 min，PBS清洗3 次，每次5 min；加入0.2%的TritonX-100通透處理5 min，PBS清洗3次，每次5 min；加入10%正常山羊血清封閉處理30 min；加一抗（空白對照試驗用PBS代替）于37℃下振蕩孵育1 h，一抗為兔抗人的細胞角蛋白8多克隆抗體（1∶100稀釋），PBS清洗3次，每次5 min；加入1∶50稀釋的FITC標記的山羊抗兔IgG 的二抗，室溫下避光振蕩孵育30 min，PBS清洗3次，每次5 min；加入DAPI使用液（10 μg/mL），室溫避光孵育10 min，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

表1 本研究所設(shè)計的引物序列

1.2.5 染色體中期分裂相制備與組型分析 細胞生長至70%-80%匯合，加入秋水仙素（終濃度0.1μg/mL），在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中作用 3 h；0.25%胰酶消化使細胞脫壁，將細胞懸液裝入15 mL 離心管，1 500 r/min離心5 min，去上清；緩緩加入37℃預(yù)熱的0.075 mol/L KCl 5 mL，37℃條件下孵育30 min；加入1 mL新鮮配制固定液（甲醇∶冰乙酸 = 3∶1）預(yù)固定3 min，1 500 r/min離心5 min，去上清；加入新鮮固定液6 mL，輕輕吹打均勻，室溫固定30 min，500 r/min離心5 min去上清，重復(fù)固定細胞2遍；末次離心后，小心吸除大部分上清液，余下0.5 mL固定液，輕輕吹打重懸細胞并混勻；膠頭滴管吸少量細胞懸液，滴落在-20℃預(yù)冷過的潔凈載玻片上，迅速在酒精燈火焰上烤干；制備好的染色體標本用Giemsa染色液浸染10 min，流水沖洗3次，自然干燥后，于顯微鏡下觀察，并進行組型分析。

2 結(jié)果

2.1 牛奶中乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)

接種3 d后，均可見許多鵝卵石樣細胞聚集生長形成的克隆，如圖1-A，以及分散生長的梭形的單個細胞，如圖1-B，同時還可見少量的吞噬細胞（圖1-A，圖1-B中標記出的細胞）；每3 d換液，繼續(xù)培養(yǎng)9 d后，形成許多大的、生長均勻的單細胞克隆，有鵝卵石和多角形狀兩種，如圖1-C和1-D；在細胞克隆的表面有分泌到胞外的乳滴，如圖1-E；同時發(fā)現(xiàn)吞噬細胞大多轉(zhuǎn)移到乳滴中，如圖1-F；原瓶消化使細胞分散，繼續(xù)培養(yǎng)2 d后，細胞在瓶底80%匯集，吞噬細胞消失，形成均勻的多角形和鵝卵石狀細胞混合生長的乳腺上皮細胞層，如圖1-G，形狀也分鵝卵石和多角形兩種。細胞傳代后凍存，復(fù)蘇后存活率高達90%，如圖1-H。

圖1 細胞培養(yǎng)圖片

2.2 MTT法測定細胞生長曲線

牛乳腺上皮細胞生長曲線如圖2所示，牛乳腺上皮細胞接種后前2 d生長相對緩慢，之后3 d進入快速生長的對數(shù)期，最后細胞生長緩慢，活性降低。結(jié)果表明，培養(yǎng)的牛乳腺上皮細胞具有正常的分裂增殖特性。

圖2 牛乳腺上皮細胞生長曲線

2.3 RT-PCR檢測角蛋白8、18以及β-酪蛋白

角蛋白8、18是乳腺上皮細胞的特異性蛋白，牛的細胞角蛋白8和18基因沒有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，提取的細胞總RNA中含有少量的基因組DNA污染，因此，在進行反轉(zhuǎn)錄之前，用DNA酶對RNA進行消化處理，以去除DNA污染的RNA為模板。將角蛋白8作為陽性對照，以提取RNA以及消化后的RNA為模板進行PCR反應(yīng)以確定基因組DNA被徹底降解，如圖3-A，用此徹底消化的RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA的第一鏈并用以合成的角蛋白8、18的引物進行PCR反應(yīng)，得到了單一的目的條帶如圖3-B和3-C。結(jié)果表明，乳汁分離法體外培養(yǎng)的乳腺上皮細胞在mRNA水平上表達細胞角蛋白8和18，具有上皮細胞特性。

酪蛋白是乳汁中含有的一種主要的蛋白，β-酪蛋白是其中一種。培養(yǎng)細胞所用的培養(yǎng)基中胰島素、孕酮以及氫化可的松的添加會刺激細胞分泌乳汁。提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄后用所設(shè)計的β-酪蛋白的引物進行PCR擴增反應(yīng)得到了目的條帶，如圖3-D，證明所培養(yǎng)的細胞具有正常的泌乳功能。

2.4 細胞免疫組化的方法鑒定角蛋白8

圖3 PCR結(jié)果

用細胞免疫組化的方法分析了分離培養(yǎng)的乳腺上皮細胞的骨架蛋白-細胞角蛋白8的表達情況，?結(jié)果分離培養(yǎng)的乳腺上皮細胞呈陽性，如圖4-A和4-B；而空白對照，即一抗用PBS替代其他處理條件相同的細胞為陰性，如圖4-C和4-D，進一步在蛋白水平上證明分離培養(yǎng)的細胞是乳腺上皮來源。

圖4 免疫組化鑒定角蛋白8

2.5 染色體中期分裂相制備與組型分析

選擇分散良好、輪廓清晰的視野進行分析（圖5-A），并進行組型排列，結(jié)果（圖5-B）顯示有60條染色體，共30對，29對常染色體為端著絲粒染色體，一對性染色體是進端著絲粒染色體，與乳牛染色體組型一致，證明所養(yǎng)細胞來源于乳牛。

圖5 核型分析結(jié)果

3 討論

3.1 牛乳腺上皮細胞的培養(yǎng)

牛乳腺上皮細胞在宿主的先天性免疫中起重要作用，因此，建立一個完善的牛乳腺上皮細胞體外培養(yǎng)模型，將有助于在體外研究乳房炎的機理。目前，被廣泛使用的方法為膠原酶消化法，但是膠原酶的消化不具有特異性，而牛乳腺組織中不僅含有乳腺上皮細胞還有大量的成纖維細胞和脂肪細胞，因此，膠原酶消化下來的細胞類型多樣，培養(yǎng)后貼壁的細胞主要是乳腺上皮細胞和成纖維細胞，成纖維細胞的生長能力很強，在培養(yǎng)過程中很難去除，但是兩種細胞對胰酶/EDTA的敏感性不同，成纖維細胞比乳腺上皮細胞容易被胰酶消化，因此主要采用胰酶消化法去除成纖維細胞，但是純化不徹底［20］。

乳腺上皮細胞是高度分化的細胞，若在體外培養(yǎng)，環(huán)境因素的影響很容易導(dǎo)致其脫分化，發(fā)生基因突變與缺失等，因此，體外培養(yǎng)過程中要不斷摸索其生長條件，添加各種生長因子，以維持其分化狀態(tài)。參考前人［11，12，21-23］對培養(yǎng)液中各因子的添加情況，本試驗采用的完全生長液配方，在該種培養(yǎng)液成分中細胞生長狀態(tài)良好。

腺泡是乳汁分泌的最小的結(jié)構(gòu)單位，由泌乳上皮細胞，導(dǎo)管上皮細胞以及肌上皮細胞等構(gòu)成的。乳汁是由乳腺上皮細胞分泌的，在分泌乳汁的過程中，會有很多乳腺上皮細胞自然脫落，隨乳汁分泌到體外，因此可以從乳汁中可以分離培養(yǎng)乳腺上皮細胞［24］。許多研究人員從常乳中不能分離培養(yǎng)乳腺上皮細胞，通過我們的研究，認為取材是關(guān)鍵的一步，首先，奶牛要選擇產(chǎn)奶量較高者；其次，在取奶是要注意無菌操作；其三，所取牛奶一定要注意保溫，冷卻的牛奶中細胞的活性很低，很難培養(yǎng)出乳腺上皮細胞；其四，也是最重要的一點，離心后棄掉上層濁液的過程一定要用槍頭緩慢吸棄，不可將槍頭插到液面以下，以防吸走分離的細胞。我們選取產(chǎn)后2-4個月的日產(chǎn)量25-40 kg的荷斯坦奶牛的新鮮牛奶為材料，并成功培養(yǎng)，說明常乳也可用于乳腺上皮細胞的培養(yǎng)。較昂貴的膠原酶消化法來說，乳汁分離法取材方便、操作簡單、培養(yǎng)周期短、細胞較為純凈，是一個乳腺上皮細胞培養(yǎng)的有效方法。該種方法分離到的細胞中除了上皮細胞外，還含有吞噬細胞，具有吞噬自身以外雜質(zhì)的能力，首先就使得培養(yǎng)的過程中污染的幾率減小，同時吞噬細胞增殖性較小，而且吞噬了雜質(zhì)的吞噬細胞會自發(fā)死亡，傳代之后吞噬細胞基本消失，有利于得到純凈的上皮細胞。

試驗中發(fā)現(xiàn)原代培養(yǎng)的過程中，吞噬細胞會向分泌到胞外的乳滴中轉(zhuǎn)移，有報道［25-27］說乳汁中的乳鐵蛋白的存在能幫助機體更好地抵御金黃色葡萄球菌等主要乳房炎病原菌的侵害，這一現(xiàn)象或許可以作為一個體外研究乳汁與病原菌作用的模型。

3.2 奶牛乳腺上皮細胞的鑒定

乳腺上皮細胞的鑒定是通過鑒別細胞的特異性標志物，其中細胞骨架如角蛋白，是乳腺上皮細胞重要的標志蛋白。本研究對腺上皮角蛋白8、18進行了RNA水平上的鑒定，并在蛋白水平上對角蛋白18用細胞免疫組化的方法進行鑒定，證明了所培養(yǎng)的細胞具有腺上皮屬性。另外，乳蛋白是乳汁的重要組成成分，在培養(yǎng)基中添加孕酮、胰島素以及氫化考的松等激素能夠誘導(dǎo)乳蛋白的表達。酪蛋白是一種主要的乳蛋白，對酪蛋白在RNA水平上的鑒定以及顯微觀察細胞生成乳滴等證明了所培養(yǎng)的細胞是能夠產(chǎn)生乳汁的上皮細胞即乳腺上皮細胞類型。由于角蛋白和酪蛋白只由一個外顯子構(gòu)成，因此提取的RNA要經(jīng)過DNA酶的消化，以防止基因組 DNA 的污染［20］。

通過對所培養(yǎng)的細胞增值的MTT法測定證明所培養(yǎng)的細胞具有正常的分裂增生能力。通過核型分析試驗證明所培養(yǎng)細胞是乳牛來源。通過對所培養(yǎng)的細胞進行鑒定，證明所培養(yǎng)的細胞是牛源的具有正常分裂增生能力以及泌乳功能的乳腺上皮細胞。

4 結(jié)論

本研究建立了乳汁分離法體外培養(yǎng)牛乳腺上皮細胞的模型，認為只要取材合適，200 mL牛乳即可用于原代培養(yǎng)乳腺上皮細胞。為乳腺上皮細胞的體外培養(yǎng)研究提供了思路，建立了簡便、經(jīng)濟、純凈的乳腺上皮細胞的原代培養(yǎng)方法。

［1］ Ebner KE, Hoover CR, Hageman EC, Larson BL. Cultivation and properties of bovine mammary cell cultures［J］. Experimental Cell Research, 1961, 23（2）：373-385.

［2］ Yang J, Richards J, Guzman R, et al. Sustained growth in primary culture of normal mammary epithelial cells embedded in collagen gels［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1980, 77：2088-2092.

［3］ Stampfer M, Hallowes RC, Hackett AJ. Growth of normal human mammary cells in culture［J］. In Vitro Celluar and Developmental Biology, 1980, 16（5）：415-425.

［4］ Michael FM. A novel system for mammary epithelial cell culture［J］.Journal of Dairy Science, 1987, 70（9）：1967-1980.

［5］ Sordillo LM, Olivera SP, Akers RM. Culture of bovine mammary epithelial cells in D-valine modified medium：Selective removal of contaminating fibroblasts［J］. Cell Biology International Reports,1988, 12（5）：355-364.

［6］ Raul AA, Karl RM, Eduardo C, et al.Staphylococcus aureusinvasion of bovine mammary epithelial cells［J］. Journal of Dairy Science,1996, 79（6）：1021-1026.

［7］ Wellnitz O, Kerr DE. Cryopreserved bovine mammary cells to model epithelial response to infection［J］. Veterinary Immunology and Immunopathology, 2004, 101：191-202.

［8］ Rose MT, Aso H, Yonekura S, et al.In vitrodifferentiation of a cloned bovine mammary epithelial cell［J］. Journal of Dairy Research, 2002, 69：345-355.

［9］ Yang W, Zerbe H, Petzl W, et al. Bovine TLR2 and TLR4 properly transduce signals fromStaphylococcus aureusandE. coli, butS. aureusfails to both activate NF-κB in mammary epithelial cells and to quickly induce TNF and interleukin-8（CXCL8）expression in the udder［J］. Molecular Immunology, 2008, 45：1385-1397.

［10］ Zhao K, Liu HY, Zhou MM, Liu JX. Establishment and characterization of a lactating bovine mammary epithelial cell model for the study of milk synthesis［J］. Cell Biology International, 2010, 34：717-721.

［11］ Hebert A, Sayasith K, Senechal S, et al. Demonstration of intracellularStaphylococcus aureusin bovine mastitis alveolar cells and macrophages isolated from naturally infected cow milk［J］. FEMS Microbiology Letters, 2000, 193：57-62.

［12］ Buehring GC. Culture of mammary epithelial cells from bovine milk［J］. Journal of Dairy Science, 1990, 73：956-963.

［13］ 崔立莉. 奶牛乳腺上皮細胞體外培養(yǎng)體系的建立及其應(yīng)用［D］. 烏魯木齊：新疆農(nóng)業(yè)大學, 2006.

［14］ Turkington RW. Stimulation of RNA synthesis in isolated mammary cells by insulin and prolactin bound to Sepharose［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1970, 41：1362-1367.

［15］ Turkington RW. The role of epithelial growth factor in mammary gland developmentin vitro［J］. Experimental Cell Research, 1969,57（1）：79-85.

［16］ Doppler W, Groner B, Ball RK. Prolactin and glucocorticoid hormones synergistically induce expression of transfected rat 13-casein gene promoter constructs in a mammary epithelial cell line［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1989, 86：104-108.

［17］ Bolander FF, Nicholcs K, Wyk JV, Topper YJ. Insulin is essential for accumulation of casein mRNA in mouse mammary epithelial cells［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1981, 78（9）：5682-5684.

［18］ Zettl KS, Sjaastad MD, Riskin PM, et al. Glucocorticoid-induced formation of tight junctions in mouse mammary epithelial cellsin vitro［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1992, 89：9069-9073.

［19］ Rudolph MC, Russell TD, Webb P, et al. Prolactin-mediated regulation of lipid biosynthesis genes in vivo in the lactating mammary epithelial cell［J］. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2011, 300（6）：E1069-68.

［20］ 多曙光, 吳應(yīng)積, 羅奮華, 旭日干. 牛乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)及其生物學特性［J］. 動物學研究, 2006, 27（3）：299-305.

［21］ Matitashvili E, Bauman DE. Culture of primary bovine mammary epithelial cells［J］. In Vitro Cellular and Developmental Biology,1999, 35（8）：431-434.

［22］ Hensen SM, Pavicic MJAMP, Lohuis JACM, Poutrel B. Use of bovine primary mammary epithelial cells for the comparison of adherence and invasion ability ofStaphylococcus aureusstrains［J］. Journal of Dairy Science, 2000, 83：418-429.

［23］ Bayles KW, Wesson CA, Liou LE, et al. IntracellularStaphylococcus aureusescapes the endosome and induces apoptosis in epithelial cells［J］. Infection and Immunity, 1998, 66（1）：336-342.

［24］ Jansson E. Transport of chemicals in normal andS. aureus-infected murine mammary epithelial HC11 cells. Faculty of Natural Resources and Agricultural Sciences, Department of Food Science, 2011.

［25］ Lacasse P, Lauzon K, Diarra MS, Petitclerc D. Utilization of lactoferrin to fight antibiotic-resistant mammary gland pathogens［J］.Journal of Animal Science, 2008, 86（13）：66-71.

［26］ Susana AG, Sigifredo AG, Quintín RC. Lactoferrin：structure,function and applications［J］. International Journal of Antimicrobial Agents, 2009, 33（301）：1-8.

［27］ Diarra MS, Petitclerc D, Lacasse P. Effect of lactoferrin in combination with penicillin on the morphology and the physiology ofstaphylococcus aureusisolated from bovine mastitis［J］. Journal of Dairy Science, 2002, 85：1141-1149.