重組角蛋白單體外源表達(dá)、純化及鑒定

宋梟梟， 周駿馳， 徐 盼， 曹張軍

東華大學(xué)東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620

角蛋白廣泛存在于脊椎動物羽毛，鱗片，爪等部位，具有不溶于水、不易降解、含硫量高等特性[1, 2]。全球每年產(chǎn)生約200萬噸羽毛[3]，羽毛中角蛋白含量占90%[4]，角蛋白相對分子量約為10 000～36 000[5,6]。角蛋白中含有大量半胱氨酸，分子內(nèi)和分子間形成大量二硫鍵，不會被常見的蛋白水解酶降解[7]。角蛋白具有出色的生物相容性和生物降解性，在蛋白質(zhì)材料方面具有廣闊前景[8]。

研究發(fā)現(xiàn)，降解羽毛首先要破壞掉其內(nèi)部的二硫鍵，氫鍵以及疏水作用，將不溶的羽毛變?yōu)榭扇艿慕堑鞍譡5]。目前提取可溶性角蛋白主要通過化學(xué)還原法溶解羽毛[9]，這些化學(xué)試劑會破壞角蛋白中的氨基酸組分，形成非營養(yǎng)性氨基酸[10]。利用微生物降解羽毛是一種高效，綠色環(huán)保的降解方法[11]，但有關(guān)微生物降解羽毛角蛋白具體機(jī)理尚無定論。曹張軍[12]從腐爛的雞毛中分離出一種羽毛降解菌株，經(jīng)測序鑒定命名為嗜麥芽窄食單胞菌DHHJ(S.maltophiliaDHHJ)。S.maltophiliaDHHJ是一種需氧型，氧化酶陰性，葡萄糖非發(fā)酵的革蘭氏陰性桿菌(GNB)，廣泛存在于水、土壤、動植物體內(nèi)[13, 14]。朱茜[15]使用羽毛粉M9培養(yǎng)基培養(yǎng)S.maltophiliaDHHJ，羽毛粉作為氮源，SDS-PAGE電泳檢測到約為10 kDa的角蛋白單體條帶。角蛋白單體是S.maltophiliaDHHJ降解羽毛過程中關(guān)鍵物質(zhì)。

化學(xué)法溶解羽毛制備的水溶性角蛋白培養(yǎng)S.maltophiliaDHHJ，培養(yǎng)基中出現(xiàn)大量的絮狀沉淀，對后續(xù)實(shí)驗(yàn)有一定的影響，且提取過程會破壞角蛋白分子中一些氨基酸，影響角蛋白的生物活性。因此，本研究通過構(gòu)建角蛋白表達(dá)載體并在大腸桿菌BL21 (DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)角蛋白單體，用于研究S.maltophiliaDHHJ降解角蛋白機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

角蛋白基因擴(kuò)增引物由生工生物公司合成，S.maltophiliaDHHJ為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種，宿主菌株 BL21(DE3)，質(zhì)粒pET32a(+)，小鼠抗6×His-tag單克隆抗體及HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠多克隆抗體購自生工生物公司，NcoⅠ和XhoⅠ購自Takara公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1角蛋白基因擴(kuò)增

在NCBI上查詢到羽毛角蛋白基因(NM_001081702.2)[16]，該基因位于雞25號染色體上，全長297 bp，將角蛋白基因插入pET-32a(+)克隆載體，克隆位點(diǎn)為NcoI/XhoI。使用熱激轉(zhuǎn)化法將重構(gòu)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中。

(1) 引物設(shè)計(jì)

使用Snap Gene設(shè)計(jì)擴(kuò)增角蛋白基因片段的引物，由生工生物公司合成。上游引物NcoI-Keratin：5′ catgccatggATGTCCTGCTTCGATCTGTG 3′；下游引物Keratin-XhoI：5′ ccgctcgagTTAGCAGGGCAGACACCTCC 3′。

(2) 角蛋白基因擴(kuò)增

將一定量的引物、模板、Taq酶、緩沖液、dNTP以及無菌水加至PCR管中，擴(kuò)增條件如下 ：1) 95℃預(yù)變性5 min，2) 95 ℃變性15 s，3) 55 ℃退火15 s，4) 72 ℃延伸15 s，30個(gè)循環(huán)，5) 72 ℃總延伸5 min，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂凝膠電泳，使用生工生物公司的膠回收試劑盒回收目的片段。

1.2.2質(zhì)粒構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

使用NcoI，XhoI快切酶切割角蛋白基因片段與pET32a(+)質(zhì)粒形成互補(bǔ)的黏性末端。酶切反應(yīng)體系(50 μL)：10×Fast Digest Buffer 5 μL；Keratin/pET32a(+)質(zhì)粒 40 μL；NcoI 2.5 μL；XhoI 2.5 μL。將上述試劑依次加至離心管中，37 ℃反應(yīng)3 h，酶切后的角蛋白基因片段與質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，回收酶切產(chǎn)物，使用T4 DNA連接試劑盒，16 ℃過夜反應(yīng)，將角蛋白基因連接到pET32a(+)載體中。使用熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)BL21(DE3)。涂布至含有氨芐青霉素的LB平板，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑選單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，同時(shí)將PCR產(chǎn)物送至生工生物進(jìn)行測序鑒定。

1.3 重組角蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

1.3.1重組角蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

溫度、IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間均會影響重組角蛋白的表達(dá)量。綜合這些因素，先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)探究誘導(dǎo)角蛋白基因表達(dá)的最適溫度，最適IPTG濃度和最適誘導(dǎo)時(shí)間。

(1) 最適誘導(dǎo)溫度

使用0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)重組角蛋白表達(dá)，分別在37 ℃培養(yǎng)4 h，18 ℃培養(yǎng)17 h，取誘導(dǎo)后的菌液進(jìn)行SDS-PAGE，判斷有無包涵體生成。

(2) IPTG最佳濃度與最佳誘導(dǎo)時(shí)間

分別使用0.5 mmol/L、0.75 mmol/L、1 mmol/L三個(gè)濃度梯度的IPTG，18 ℃，分別培養(yǎng)15 h、17 h和19 h，取誘導(dǎo)后的菌液進(jìn)行SDS-PAGE。

1.3.2重組角蛋白純化與鑒定

(1) 使用上述實(shí)驗(yàn)得出的最適條件誘導(dǎo)重組菌株角蛋白基因表達(dá)，5 000 r/min，4 ℃離心20 min收集菌體，使用細(xì)胞破碎儀破碎菌體，12 000 r/min，4 ℃離心20 min，收集上清液，使用0.45 μm孔徑的過濾器除去上清液中的不溶物。

(2) 使用Ni柱親和層析法純化上清液中的重組角蛋白，使用咪唑濃度為40 mmol/L的洗滌液除去雜蛋白，咪唑濃度為250 mmol/L洗脫液洗脫結(jié)合在Ni柱上的重組角蛋白。將重組角蛋白溶液裝入透析袋置于50 mmol/L的Tris緩沖液(pH=7.8)中，過夜透析，除去咪唑，測定重組角蛋白濃度與產(chǎn)量。

(3) 重組角蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜上(恒流300 mA，100 min)。PVDF膜放入封閉液中封閉30 min，棄去封閉液，PBS洗膜2次。加入1∶1 000稀釋的小鼠抗6×His單克隆抗體，4 ℃過夜孵育，使用TBST清洗PVDF膜3次，每次5 min，除去未結(jié)合的一抗。加入1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠多克隆抗體室溫孵育30 min。TBST洗5次，每次5 min，洗去未結(jié)合的二抗。ECL顯影法顯色，凝膠成像儀記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.4 重組角蛋白活性檢測

1.4.1重組角蛋白M9培養(yǎng)基中S.maltophiliaDHHJ生長狀況

取1 mL角蛋白M9培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)的S.maltophiliaDHHJ菌液，離心(10 000 r/min，2 min)收集菌體，PBS清洗菌體2次，加入2.5%戊二醛固定劑固定4 h； PBS清洗菌體2次，依次使用30%、50%、70%、90%、100%、100%乙醇溶液逐級脫水，每次15 min；叔丁醇置換30 min；烘干，使用無水乙醇重懸菌體，取一滴菌液滴加在鋁箔上，噴金，場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀測。

1.4.2角蛋白酶活性測定

角蛋白酶活性測試方法參考郝亞楠[17]，取4 mL重組角蛋白M9培養(yǎng)中的S.maltophiliaDHHJ，10 000 r/min，4 ℃離心5 min，收集上清液。稱取10 mg羽毛粉作為底物，加入1 mL上清液，2 mL Tris緩沖液(50 mmol/L，pH=7.8)，40 ℃水浴1 h，加入2 mL 10%三氯乙酸溶液4 ℃靜置30 min終止反應(yīng)，離心(10 000 r/min，4 ℃，10 min)，測定上清液280 nm處的吸光度。每組做三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，水浴前加入2 mL 10%三氯乙酸溶液作空白對照組。角蛋白酶活性的定義為280 nm處的吸光值每增加0.1為1 U。

2 結(jié)果與討論

2.1 重組菌株構(gòu)建

角蛋白基因在NcoI和XhoI兩種快切酶作用下形成黏性末端(圖1a)，pET32a(+)載體全長5 900 bp，經(jīng)過NcoI和XhoI酶切后形成與角蛋白基因互補(bǔ)的黏性末端，T4 DNA連接試劑盒將角蛋白基因與載體連接，使用熱激法將重組載體導(dǎo)入BL21(DE3)中得到重組菌株BL21(DE3)-pET32a(+)-Keratin(圖1c)。

a

b

c

2.2 重組角蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

圖2a是18 ℃，17 h誘導(dǎo)角蛋白基因表達(dá)電泳圖，加入IPTG后出現(xiàn)重組角蛋白，菌體破碎后上清液含有重組角蛋白而沉淀中沒有，證明無包涵體產(chǎn)生，菌體表達(dá)的是可溶性重組角蛋白。圖2b是37 ℃，4 h誘導(dǎo)角蛋白基因表達(dá)電泳圖，上清液和沉淀均出現(xiàn)重組角蛋白，誘導(dǎo)過程中形成包涵體，影響重組角蛋白的產(chǎn)量。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用低溫(18 ℃)誘導(dǎo)角蛋白基因表達(dá)。

a

b

a: 18 ℃誘導(dǎo)17 h； b: 37 ℃誘導(dǎo)4 h
圖2 重組角蛋白外源表達(dá)

圖3a和b是重組角蛋白IPTG最適誘導(dǎo)條件電泳結(jié)果，誘導(dǎo)溫度為18 ℃，IPTG濃度分別為0.5 mmol/L、0.75 mmol/L和1.0 mmol/L，培養(yǎng)時(shí)間分別為15 h、17 h和19 h。圖3c是對應(yīng)的重組角蛋白灰度值，結(jié)果顯示IPTG濃度是0.5 mmol/L培養(yǎng)15 h和IPTG濃度0.75 mmol/L培養(yǎng)17 h，重組角蛋白表達(dá)量最高。因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用IPTG濃度為0.5 mmol/L培養(yǎng)15 h誘導(dǎo)重組角蛋白表達(dá)。

a和b為IPTG誘導(dǎo)濃度及誘導(dǎo)時(shí)間角蛋白單體產(chǎn)量；c為對應(yīng)條帶灰度值
圖3 IPTG濃度與培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)化蛋白表達(dá)量SDS-PAGE檢測

圖4a中，經(jīng)過Ni柱親和層析法純化得到重組角蛋白，蛋白條帶顏色較深，無明顯雜帶，經(jīng)測定重組角蛋白產(chǎn)量約為40 mg/L，濃度約為2 mg/mL。圖4b中，b泳道與c泳道對應(yīng)位置均出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，證明純化得到的蛋白就是重組角蛋白。

a: SDS-PAGE；b: Western Blotting
圖4 重組角蛋白純化與Western Blotting鑒定

2.3 重組角蛋白單體生物活性檢測

不同來源的角蛋白M9培養(yǎng)基培養(yǎng)S.maltophiliaDHHJ 24 h后，培養(yǎng)液情況如圖5所示。重組角蛋白培養(yǎng)基與牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)的溶液外觀相似(顯現(xiàn)均勻渾濁)，細(xì)菌能夠利用重組角蛋白維持正常生理活動，試管中未出現(xiàn)絮狀沉淀。羽毛水解角蛋白在S.maltophiliaDHHJ作用下，試管底部出現(xiàn)大量絮狀沉淀，溶解性較差。

a: 重組角蛋白培養(yǎng)基；b: 羽毛水解角蛋白培養(yǎng)基圖5 S.maltophilia DHHJ在不同培養(yǎng)基中生長狀況

將上述培養(yǎng)的S.maltophiliaDHHJ細(xì)胞固定，電鏡觀察見圖6。由圖6知，試管底部絮狀沉淀是S.maltophiliaDHHJ菌體與析出的角蛋白混合物，角蛋白從培養(yǎng)基中析出包裹在菌體表面沉淀到試管底部，對菌體生長以及生物活性造成一定影響，而重組角蛋白溶解性高于化學(xué)水解角蛋白，培養(yǎng)過程中不會析出，有利于菌體生長，同時(shí)也更有利于作為研究S.maltophiliaDHHJ降解角蛋白機(jī)理的底物。

a

b

ca: 重組角蛋白培養(yǎng)基； b: 化學(xué)水解角蛋白培養(yǎng)基； c: 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基圖6 S.maltophilia DHHJ不同來源角蛋白培養(yǎng)基下形態(tài)觀察

如圖7所示，羽毛粉、化學(xué)水解角蛋白、重組角蛋白均能誘導(dǎo)S.maltophiliaDHHJ分泌角蛋白酶。在角蛋白等誘導(dǎo)物作用下，S.maltophiliaDHHJ分泌大量的角蛋白酶。三種誘導(dǎo)培養(yǎng)基中角蛋白酶活性變化趨于一致，24 h開始出現(xiàn)明顯的角蛋白酶活性，48 h角蛋白酶活性最高，隨著菌體消耗，角蛋白酶活性開始下降，但72 h時(shí)，重組角蛋白M9培養(yǎng)基中角蛋白酶活性明顯高于其它兩組，由于化學(xué)水解角蛋白在菌體的作用下會析出，而重組角蛋白則不會，培養(yǎng)基中重組角蛋白含量相對較高，因此，角蛋白酶活性也較高。

圖7 三種誘導(dǎo)物誘導(dǎo)S.maltophilia DHHJ分泌角蛋白酶

3 結(jié)論

本文將角蛋白基因插入到pET32a(+)質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)菌株BL21(DE3)。IPTG低溫誘導(dǎo)角蛋白基因大量表達(dá)，利用Ni柱親和層析法分離純化得到重組角蛋白。重組角蛋白溶解性高于化學(xué)水解角蛋白，與S.maltophiliaDHHJ培養(yǎng)的過程中不會析出，重組角蛋白中帶有His-tag與S-tag等標(biāo)簽，有利于重組角蛋白的純化與鑒定。重組角蛋白具有生物活性能夠被S.maltophiliaDHHJ結(jié)合并誘導(dǎo)菌體分泌角蛋白酶，可用于后續(xù)S.maltophiliaDHHJ降解角蛋白機(jī)制的研究。