土霉素生產(chǎn)優(yōu)良菌株的篩選與發(fā)酵條件優(yōu)化

王子竹， 王紅英， 劉進(jìn)文， 尹麗景， 錢斯日古楞*

1.大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034；2.內(nèi)蒙古華曙生物科技有限公司，內(nèi)蒙古 通遼 028400

土霉素(Oxytetracycline，OTC)又稱地霉素、氧四環(huán)素和5-羥基四環(huán)素，是一種化合物(分子式為C22H24N2O9)，其相對(duì)分子質(zhì)量為460.44。土霉素為淡黃色晶體，酸堿的兩性分子，微溶于水。土霉素具有廣譜抗菌作用，對(duì)革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌均具有較好的抑制生長效果。土霉素的抗菌機(jī)制主要是通過與細(xì)菌核糖體的30S小亞基結(jié)合，干擾氨酰-tRNA與核糖體的結(jié)合，阻礙細(xì)菌蛋白合成進(jìn)程，從而達(dá)到抑制細(xì)菌繁殖的效果。由于土霉素毒副作用小，生產(chǎn)率高，因此在醫(yī)療，尤其是在畜牧業(yè)的醫(yī)療中廣泛應(yīng)用[1-3]。

要提高土霉素產(chǎn)量，除了要求生產(chǎn)菌株具備優(yōu)良的生產(chǎn)性能外[4]，還必須要有合適的培養(yǎng)基。不同的菌株對(duì)培養(yǎng)基組分要求不同，同為龜裂鏈霉菌屬的不同菌株對(duì)培養(yǎng)基有著不同的需求。因此，篩選出土霉素高產(chǎn)菌株后還需對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，提高發(fā)酵產(chǎn)量，達(dá)到最高生產(chǎn)效率，同時(shí)盡量降低生產(chǎn)成本。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌種

菌種是實(shí)驗(yàn)室保存的土霉素產(chǎn)生菌(土壤來源)。

1.1.2試劑

土霉素標(biāo)準(zhǔn)品(HPLC≥95%)，北京索萊寶科技有限公司銷售；葡萄糖、草酸、硫酸銨、碳酸鈣、硝酸鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸鐵、氯化鈉、瓊脂粉、氫氧化鈉、氯化鈷、硫酸鋅、鹽酸、氯化鐵等均國產(chǎn)分析純；可溶性淀粉、麩皮、黃豆餅粉、玉米漿、小米、蛋白胨、玉米淀粉、3，5-二硝基水楊酸(DNS)試劑等均為本地試劑公司銷售的實(shí)驗(yàn)用品。

1.1.3儀器

TU-1901紫外分光光度計(jì)，北京譜析通用儀器公司；MULTIPLEX1R32R大型離心機(jī)，賽默飛世爾科技公司；霉菌培養(yǎng)箱MJ-16085-III，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；ZHWY2102C立式雙層恒溫?fù)u床，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.1.4培養(yǎng)基

1.1.4.1土霉素生產(chǎn)菌種活化培養(yǎng)基

(1) 菌種活化培養(yǎng)基1號(hào)(g/L)：可溶性淀粉25、酵母粉2、蛋白胨1、氯化鈉2.5、硫酸鎂2.5、磷酸二氫鉀0.5、磷酸氫二鉀0.5、瓊脂粉18、去離子水，調(diào)pH至6.8～7.2，121 ℃，1.01 MPa，條件下滅菌20 min。

(2) 菌種活化培養(yǎng)基2號(hào)(g/L)：麩皮65、瓊脂粉20、去離子水，調(diào)pH至6.8～7.2，121 ℃，1.01 MPa，條件下滅菌20 min。

1.1.4.2土霉素生產(chǎn)菌種種子培養(yǎng)基[5,6]

(1) 菌種種子培養(yǎng)基1號(hào)(g/L)：葡萄糖10、蛋白胨3、氯化鈉2.5、碳酸鈣0.2、1%小米浸提物、去離子水，調(diào)pH至6.8～7.2，121 ℃，1.01 MPa，條件下滅菌20 min。

(2) 菌種種子培養(yǎng)基2號(hào)(g/L)：玉米淀粉30、黃豆餅粉3、硫酸銨4、碳酸鈣5、玉米漿4、氯化鈉5、磷酸二氫鉀0.1、去離子水，調(diào)pH至6.8～7.2，121 ℃，1.01 MPa，條件下滅菌20 min。

(3) 菌種種子培養(yǎng)基3號(hào)(g/L)：可溶性淀粉30、玉米漿5、氯化鈉2、硫酸銨6、碳酸鈣3、磷酸二氫鉀4、去離子水，調(diào)pH至6.8～7.2，121 ℃，1.01 MPa，條件下滅菌20 min。

1.1.4.3土霉素生產(chǎn)菌種發(fā)酵培養(yǎng)基[6,7]

(1) 發(fā)酵培養(yǎng)基1號(hào)(g/L)：玉米淀粉150、黃豆餅粉20、碳酸鈣12、硫酸銨14、氯化鈉4、玉米漿4、磷酸二氫鉀0.1、氯化鈷0.01、消泡劑0.1、去離子水，調(diào)pH至6.8～7.2，121 ℃，1.01 MPa，條件下滅菌20 min。

(2) 發(fā)酵培養(yǎng)基2號(hào)(g/L)：玉米淀粉120、黃豆餅粉20、碳酸鈣15、硫酸銨15、氯化鈉4、玉米漿10、磷酸二氫鉀0.1、氯化鈷0.01、消泡劑0.1、淀粉酶0.12、去離子水，調(diào)pH至6.8～7.2，121 ℃，1.01 MPa，條件下滅菌20 min。

(3) 發(fā)酵培養(yǎng)基3號(hào)(g/L)：玉米淀粉90、黃豆餅粉30、碳酸鈣9、硫酸銨10、氯化鈉25、玉米漿10、磷酸二氫鉀0.5、硫酸鋅0.02、去離子水，調(diào)pH至6.8～7.2，121 ℃，1.01 MPa，條件下滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1土霉素生產(chǎn)菌的分離、純化

將實(shí)驗(yàn)室保存的土霉素產(chǎn)生菌斜面或茄子瓶孢子刮下加入到裝有無菌水和玻璃珠的三角瓶中，在恒溫震蕩搖床200 r/min震蕩5 min后得分散的孢子液，調(diào)整濃度為105CFU/mL；涂布平板后，先在37 ℃條件下培養(yǎng)3 d，然后轉(zhuǎn)到30 ℃，繼續(xù)培養(yǎng)1 d，得到分散生長的單菌落，觀察其形態(tài)[4,8-9]。而后將不同的單菌落上的孢子分別制成低濃度的孢子液，涂布平板，得到純化單菌落菌株[10-12,14]。

1.2.2土霉素生產(chǎn)菌株的抑菌活性檢測

在37 ℃平板培養(yǎng)3 d的單菌落，用滅菌的打孔器將單菌落連同瓊脂取出后，置于均勻涂布八疊球菌菌懸液的平板上，在30 ℃條件下培養(yǎng)1 d，測量其抑菌圈直徑，通過對(duì)抑菌圈大小的統(tǒng)計(jì)和分析，比較不同菌株的抑菌活性[6,12-13,15-16]。

1.2.3菌株產(chǎn)生土霉素效價(jià)的測定

將待測土霉素的發(fā)酵液用草酸酸化至pH 1.5～1.7，靜置5 min后過濾；取1 mL濾液與9 mL 0.01 mol/L鹽酸和10 mL 0.05%氯化鐵溶液混合，搖勻，靜置20 min后，測定其OD480 nm，經(jīng)過公式計(jì)算得到效價(jià)。1 mL濾液與19 mL 0.01 mol/L鹽酸混合，搖勻，靜置20 min，作為對(duì)照組[17,18]。

土霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備是以土霉素標(biāo)準(zhǔn)品為標(biāo)準(zhǔn)物，鹽酸和氯化鐵配制的溶液為顯色劑，得到的回歸方程式為y=8 763.9x+149.32，R2=0.993 2。

效價(jià)計(jì)算公式：

土霉素總效價(jià)=土霉素效價(jià)×稀釋倍數(shù)

1.2.4土霉素生產(chǎn)菌株的菌種活化

將在活化培養(yǎng)基2號(hào)中保存的菌株B用無菌水配置成一定濃度的孢子液，在菌種活化培養(yǎng)基1號(hào)上均勻涂布，在37 ℃條件下培養(yǎng)3 d后轉(zhuǎn)到30 ℃條件，繼續(xù)培養(yǎng)1 d，獲得活化的土霉素生產(chǎn)菌株B。

1.2.5土霉素生產(chǎn)菌最適種子培養(yǎng)基

將一定濃度菌株B的孢子液取出3份2 mL，分別轉(zhuǎn)接到裝有35 mL種子培養(yǎng)基1號(hào)、2號(hào)和3號(hào)的250 mL三角瓶中，在30 ℃，220 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)1 d。各取出2 mL，分別轉(zhuǎn)接到裝有35 mL發(fā)酵培養(yǎng)基1號(hào)的三個(gè)250 mL三角瓶中，在30 ℃，220 r/min培養(yǎng)。在培養(yǎng)期間每2 d測一次發(fā)酵液中的土霉素效價(jià)，觀察種子培養(yǎng)基種類對(duì)土霉素產(chǎn)量的影響[3,9]。

1.2.6土霉素生產(chǎn)菌最適發(fā)酵培養(yǎng)基

(1) 最適發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇

從土霉素生產(chǎn)菌株B孢子液中吸取2 mL轉(zhuǎn)接到裝有35 mL種子培養(yǎng)基2號(hào)的250 mL三角瓶中，在30 ℃，220 r/min條件下培養(yǎng)1 d后，分別取2 mL種子液轉(zhuǎn)接到裝有35 mL發(fā)酵培養(yǎng)基1號(hào)、2號(hào)和3號(hào)的250 mL三角瓶中，在30 ℃，220 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中每2d測一次發(fā)酵液中的土霉素效價(jià)，觀察發(fā)酵培養(yǎng)基種類對(duì)土霉素產(chǎn)量的影響。

(2) 淀粉酶預(yù)處理發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)土霉素發(fā)酵的影響

淀粉酶(3 700 U/g)與天然成分(玉米淀粉、黃豆餅粉、玉米漿)按1∶1 250的比例混合，加入適量去離子水，調(diào)節(jié)pH 6.5，在45 ℃，160 r/min條件下，搖瓶反應(yīng)3 h后，再添加其它發(fā)酵培養(yǎng)基成分和去離子水，高溫高壓滅菌，使預(yù)處理所添加的淀粉酶失活。

將菌株B孢子液吸取2 mL，加入到裝有35 mL種子培養(yǎng)基2號(hào)的250 mL三角瓶中，在30 ℃，220 r/min條件下，搖瓶培養(yǎng)1 d。從中吸取2份2 mL，分別轉(zhuǎn)接到裝有35 mL經(jīng)過淀粉酶預(yù)處理的發(fā)酵培養(yǎng)基2號(hào)的250 mL三角瓶和裝有35 mL未經(jīng)淀粉酶處理的發(fā)酵培養(yǎng)基2號(hào)的250 mL三角瓶中對(duì)照，均在30 ℃，220 r/min條件下，搖瓶培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中每2 d測一次發(fā)酵液中的土霉素效價(jià)，觀察淀粉酶預(yù)處理的發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)土霉素產(chǎn)量的影響。

1.2.7發(fā)酵過程中的淀粉酶活力與菌株產(chǎn)生土霉素的關(guān)系

將2 mL的三種不同種子液分別轉(zhuǎn)接到裝有35 mL發(fā)酵培養(yǎng)基2號(hào)的250 mL三角瓶中，在30 ℃，220 r/min條件下?lián)u瓶培養(yǎng)。測定不同時(shí)期發(fā)酵液中的淀粉酶活力和土霉素效價(jià)，觀察淀粉酶活力與土霉素產(chǎn)量的關(guān)系。

淀粉酶活測定采用DNS法[19,20]，以無水葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物，DNS試劑為顯色劑，在540 nm處測定其吸光值，得到的回歸方程式為y=7.816 7x+0.018 4，R2=0.998 1。

取10 g可溶性淀粉，加入到100 mL容量瓶定容，配成100 mg/mL的淀粉溶液，將待測土霉素的發(fā)酵液倒入離心管中，6 000 r/min條件下離心10 min。取1.5 mL淀粉溶液加入到試管中,再取1 mL上清液加入到試管中，30 ℃水浴加熱10 min后，取0.5 mL水解液加入到25 mL試管中，再向試管中加入1.5 mL DNS試劑和1.5 mL去離子水，沸水浴 5 min，冷卻后定容至25 mL，測OD540nm，經(jīng)過公式計(jì)算得到淀粉酶活力。取0.5 mL淀粉溶液、1.5 mL DNS試劑和1.5 mL去離子水，沸水浴 5 min，冷卻后定容至25 mL，作為對(duì)照組。

淀粉酶活力定義為，在30 ℃、pH 6.0的條件下，每分鐘水解淀粉生成1 mg還原糖所需的酶量為一個(gè)活性單位(U)。

10——發(fā)酵液與底物反應(yīng)時(shí)間/min

0.5——水解液體積/mL

1——發(fā)酵液體積/mL

2 結(jié)果與討論

2.1 土霉素生產(chǎn)菌的分離、純化與抑菌活性

2.1.1土霉素生產(chǎn)菌株的形態(tài)特征

將斜面保存的菌株孢子用無菌水制備均勻孢子液，進(jìn)行稀釋后，涂布平板分離，并觀察其產(chǎn)生菌落的形態(tài)特征，結(jié)果如圖1。

在分離平板上出現(xiàn)了三種不同特征的菌落，菌落A、菌落B、菌落C。對(duì)三種菌落的孢子再次進(jìn)行稀釋、涂布后得到單一菌落，結(jié)果如圖2。

菌落A密實(shí)潔白，質(zhì)地硬，表面為車輪狀，孢子豐滿；菌落B密實(shí)，棕褐色，質(zhì)地硬，表面為車輪狀，孢子量不豐滿；菌落C密實(shí)，深褐色，質(zhì)地硬，表面為車輪狀，孢子較少。

2.1.2土霉素生產(chǎn)菌株的抑菌活性

從供試混合菌中分離得到的三種菌落(A,B,C)中的菌株在涂布八疊球菌培養(yǎng)基上，能夠形成明顯的抑菌圈，結(jié)果如圖3和表1。

通過測量產(chǎn)生抑菌圈大小，統(tǒng)計(jì)和分析后發(fā)現(xiàn)，菌株B產(chǎn)生的抑菌圈平均直徑最大為27.25 mm，且效果最穩(wěn)定，抑菌圈邊緣清晰，對(duì)八疊球菌抑菌活性最明顯；菌株C雖抑菌圈邊緣清晰，有明顯抑菌活性，但抑菌效果不穩(wěn)定；菌株A抑菌圈邊緣模糊，抑菌圈平均直徑較小，且抑菌效果不穩(wěn)定。因此將菌株B作為后續(xù)試驗(yàn)的出發(fā)菌株。

Ⅰ 分離平板

Ⅱ 三種不同菌落的形態(tài)(A,B,C)

菌落 A

菌落 B

菌落 C圖2 菌株菌落特征

菌落 A

菌落 B

菌落 C圖3 土霉素生產(chǎn)菌株產(chǎn)生的抑菌圈

表1 菌株(A,B,C)的抑菌圈直徑

2.2 土霉素生產(chǎn)菌(菌株B)在未經(jīng)優(yōu)化生產(chǎn)條件下的最適發(fā)酵時(shí)間

將菌株B用種子培養(yǎng)基2號(hào)制成種子液，轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基2號(hào)中，在一定條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，每2 d測定其土霉素效價(jià)，結(jié)果如圖4。

圖4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)生土霉素的影響

由種子培養(yǎng)基1號(hào)制成的菌株B種子液，在發(fā)酵培養(yǎng)基2號(hào)上進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)前4 d土霉素累積量最快，第4 d后進(jìn)入緩慢增長期，在第8 d時(shí)達(dá)到最高8 943 U/mL。因此菌株B在發(fā)酵培養(yǎng)基2號(hào)上產(chǎn)生土霉素的最適培養(yǎng)時(shí)間確定為8 d。

2.3 土霉素生產(chǎn)菌(菌株B)的最適種子培養(yǎng)基

將菌株B分別用種子培養(yǎng)基1號(hào)、2號(hào)和3號(hào)制成3種種子液，再分別轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基1號(hào)中，在一定條件下?lián)u瓶培養(yǎng)8 d，發(fā)酵過程中土霉素產(chǎn)量與時(shí)間的關(guān)系如圖5所示。

圖5 不同種子培養(yǎng)基對(duì)發(fā)酵產(chǎn)生土霉素的影響

由圖5可見，通過對(duì)土霉素效價(jià)變化比較發(fā)現(xiàn)，三種種子培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株B在發(fā)酵培養(yǎng)的前4 d，土霉素均大量累積，而第4 d到第6 d累積速度變慢，但第6 d后土霉素累計(jì)速度再次加大，出現(xiàn)峰值。種子培養(yǎng)基1號(hào)中含有葡萄糖和小米，葡萄糖較淀粉更易利用，因此，轉(zhuǎn)接時(shí)種子培養(yǎng)基1號(hào)中的菌株發(fā)育程度更高，轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)可以更短時(shí)間進(jìn)入次級(jí)代謝，積累土霉素。小米中含有大量天然淀粉，刺激菌株產(chǎn)生淀粉酶，提高菌株產(chǎn)淀粉酶活力，后續(xù)發(fā)酵過程提高菌株利用淀粉能力。

種子培養(yǎng)基1號(hào)培養(yǎng)的菌株B發(fā)酵積累土霉素量均比其它兩種種子培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株B高，效價(jià)為9 533 U/mL，提高了6.59%。因此將種子培養(yǎng)基1號(hào)為菌株B發(fā)酵生產(chǎn)土霉素的最適種子培養(yǎng)基。

2.4 土霉素生產(chǎn)菌(菌株B)的最適發(fā)酵培養(yǎng)基

將菌株B用種子培養(yǎng)基1號(hào)制成種子液，取三份2 mL，分別轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基1號(hào)、2號(hào)和3號(hào)中，在同一條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，每2 d測定其土霉素效價(jià)，結(jié)果如圖6所示。

圖6 不同發(fā)酵培養(yǎng)基對(duì)菌株產(chǎn)生土霉素的影響

如圖6所示，由種子培養(yǎng)基1號(hào)制成的菌株B種子液，在發(fā)酵培養(yǎng)基1號(hào)、2號(hào)和3號(hào)中培養(yǎng)時(shí)，土霉素效價(jià)均隨發(fā)酵時(shí)間延長而增加。其中菌株在發(fā)酵培養(yǎng)基2號(hào)中培養(yǎng)的前2 d，土霉素累積速度較慢，但從第2 d開始土霉素累積量增加，速度加快，且趨勢穩(wěn)定；而發(fā)酵培養(yǎng)基1號(hào)和3號(hào)的土霉素積累量隨培養(yǎng)時(shí)間增加，但均比發(fā)酵培養(yǎng)基2號(hào)積累的土霉素少，發(fā)酵培養(yǎng)基2號(hào)中最終效價(jià)為10 247 U/mL，又提高了7.49%，因此發(fā)酵培養(yǎng)基2號(hào)為菌株B的最適發(fā)酵培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基2號(hào)中成分與1號(hào)相比，玉米漿濃度更大，玉米淀粉濃度更小；與3 號(hào)相比，玉米淀粉濃度更大，黃豆餅粉濃度更小。培養(yǎng)基中碳氮比最高的1號(hào)產(chǎn)量最低，碳氮比最低的2號(hào)產(chǎn)量最高。從這個(gè)角度來看，碳氮比低更適合菌株B發(fā)酵生產(chǎn)，但是具體的比例在什么范圍內(nèi)最好，碳源和氮源的濃度在何范圍內(nèi)更適合生產(chǎn)還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

將菌株B用種子培養(yǎng)基1號(hào)制成種子液，取兩份2 mL，分別轉(zhuǎn)接到未經(jīng)淀粉酶預(yù)處理的發(fā)酵培養(yǎng)基2號(hào)和經(jīng)淀粉酶預(yù)處理的發(fā)酵培養(yǎng)基2號(hào)中，在同一條件下?lián)u瓶培養(yǎng)，每2 d測定其土霉素效價(jià)，結(jié)果如圖7所示。

對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基2號(hào)成分的淀粉酶預(yù)處理研究發(fā)現(xiàn)(見圖7)，經(jīng)淀粉酶預(yù)處理的發(fā)酵培養(yǎng)基2號(hào)中，菌株B對(duì)土霉素累積速度明顯比未經(jīng)淀粉酶處理的快，而且在培養(yǎng)第6 d時(shí)效價(jià)達(dá)到最高11 023 U/mL，又提高了7.57%，并趨于平穩(wěn)。

目前土霉素生產(chǎn)菌株普遍存在產(chǎn)淀粉酶能力較低，淀粉利用率較弱的現(xiàn)象，發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)過淀粉酶預(yù)處理，其碳源被水解更容易被利用，從而大大提高物料利用率，縮短發(fā)酵生產(chǎn)土霉素時(shí)間。因此，發(fā)酵培養(yǎng)基配制前，對(duì)天然成分進(jìn)行淀粉酶預(yù)處理，可增加土霉素產(chǎn)量。但是發(fā)酵培養(yǎng)基預(yù)處理時(shí)的淀粉酶與天然成分的比例和處理時(shí)間仍需進(jìn)一步研究。

但是生產(chǎn)的前6 d產(chǎn)量持續(xù)上升，因此峰值在4 d～6 d區(qū)間內(nèi)出現(xiàn)，為得到更加準(zhǔn)確地生產(chǎn)時(shí)間，下一步應(yīng)從第4 d開始，每2 h測一次效價(jià)，進(jìn)一步得到最佳發(fā)酵時(shí)間。

2.5 菌株產(chǎn)淀粉酶能力與其土霉素產(chǎn)量的關(guān)系

將菌株B用種子培養(yǎng)基1號(hào)制成種子液，轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基1號(hào)中，在一定條件下?lián)u瓶培養(yǎng)8 d，每2 d測定其發(fā)酵液中的土霉素效價(jià)和淀粉酶活力，結(jié)果如圖8。

圖8 菌株土霉素產(chǎn)量與其淀粉酶活力的關(guān)系

由圖8可見，由種子培養(yǎng)基1號(hào)制成的菌株B種子液，在發(fā)酵培養(yǎng)基1號(hào)上進(jìn)行培養(yǎng)，通過比較其中土霉素效價(jià)和淀粉酶活力的變化趨勢發(fā)現(xiàn)，從發(fā)酵第2 d開始菌株土霉素積累加速，第4 d時(shí)進(jìn)入緩慢期，但從第6 d起又進(jìn)入土霉素積累快速期。與之相比淀粉酶的酶活從種子液到發(fā)酵結(jié)束，保持一定水平，沒有明顯的波動(dòng)。但是淀粉酶預(yù)處理發(fā)酵培養(yǎng)基可以明顯提高產(chǎn)量，因此需要進(jìn)一步研究淀粉酶與土霉素生產(chǎn)之間的關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)中只研究了發(fā)酵液中淀粉酶活力變化與土霉素產(chǎn)量變化之間的關(guān)系，下一步應(yīng)對(duì)種子液中淀粉酶活力與土霉素最終產(chǎn)量之間的關(guān)系進(jìn)行研究。

3 結(jié)論

(1) 在最適種子培養(yǎng)基選擇實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，以種子培養(yǎng)基1號(hào)作為種子培養(yǎng)基時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)生土霉素的產(chǎn)量更高，并且種子培養(yǎng)基1號(hào)具有配方簡單，易配制等優(yōu)點(diǎn)，綜合分析后，種子培養(yǎng)基1號(hào)為最適種子培養(yǎng)基。在最適發(fā)酵培養(yǎng)基的選擇實(shí)驗(yàn)中，發(fā)酵培養(yǎng)基2號(hào)為最適發(fā)酵培養(yǎng)基，效價(jià)達(dá)到10 247 U/mL。而且發(fā)酵培養(yǎng)基2號(hào)經(jīng)淀粉酶預(yù)處理可以有效縮短發(fā)酵時(shí)間至6 d，效價(jià)達(dá)到11 023 U/mL。因此，綜合考慮生產(chǎn)成本、生產(chǎn)效益等因素，菌株B在經(jīng)過淀粉酶預(yù)處理的發(fā)酵培養(yǎng)基2號(hào)中發(fā)酵培養(yǎng)6 d為最佳。

(2) 發(fā)酵液中的淀粉酶活力的變化與菌株土霉素產(chǎn)量的變化沒有明顯關(guān)系，土霉素產(chǎn)量增加加快時(shí)，淀粉酶活力沒有相應(yīng)增加。

(3) 在未優(yōu)化的生產(chǎn)條件下發(fā)酵培養(yǎng)，原混合菌產(chǎn)量為6 430 U/mL，菌株B產(chǎn)量為8 943 U/mL，高于原混合菌39%。菌株B在經(jīng)過淀粉酶預(yù)處理的發(fā)酵培養(yǎng)基2號(hào)中發(fā)酵培養(yǎng)6 d的產(chǎn)量為11 023 U/mL，較未分離純化原菌株效價(jià)提高了71.43 %。由此可見，通過篩選優(yōu)良菌株、優(yōu)化生產(chǎn)條件提高微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的方法是經(jīng)濟(jì)有效的。