不同稀釋液對(duì)免疫層析法糞便隱血試驗(yàn)的影響

姚曉賓，王 丹，馬衛(wèi)國(guó)，曹偉娟，盛家和

(河南省腫瘤醫(yī)院 檢驗(yàn)科，鄭州 450008)

不同稀釋液對(duì)免疫層析法糞便隱血試驗(yàn)的影響

姚曉賓，王 丹，馬衛(wèi)國(guó)，曹偉娟，盛家和

(河南省腫瘤醫(yī)院 檢驗(yàn)科，鄭州 450008)

摘要：目的比較采用生理鹽水、去離子水、自來水作為樣本稀釋液對(duì)免疫層析糞便隱血試驗(yàn)結(jié)果的影響，明確隱血試驗(yàn)最適稀釋液，提高隱血試驗(yàn)的準(zhǔn)確率。方法采集正常人抗凝全血，用3種稀釋液對(duì)其倍比稀釋后進(jìn)行隱血檢測(cè)。通過肉眼觀測(cè)及 Image J 圖像處理軟件灰度分析，比較三者差異。連續(xù) 2 周收集臨床糞便標(biāo)本，潛血檢測(cè)使用 3 種稀釋液同時(shí)測(cè)定，計(jì)算陽性率差異。結(jié)果全血檢測(cè)生理鹽水組灰度明顯高于其他 2 組，P<0.05；自來水組和去離子水組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05；生理鹽水/去離子水灰度比為 1.78±0.85；生理鹽水/自來水灰度比為 2.12±0.72；自來水/去離子水灰度比為 0.80±0.05。結(jié)論生理鹽水是糞便隱血試驗(yàn)的最適稀釋液，相比其他稀釋液，具有較高的陽性檢出率。

關(guān)鍵詞：生理鹽水；去離子水；自來水；糞便隱血試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：R446.13

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：編號(hào)： 1672-7606(2015)01-0040-03

收稿日期：2014-08-15

作者簡(jiǎn)介：姚曉賓(1979—)， 男，河南靈寶人， 碩士，主管技師，從事臨床檢驗(yàn)診斷的工作。

Abstract:ObjectiveComparison of normal saline, deionized water, tap water as the sample diluent for immunochromatographic fecal occult blood test to confirm optimum dilution for occult blood test and improve the accuracy of the occult blood test. MethodsAcquisition normal anticoagulated whole blood and occult blood detection with three dilutes. Comparison of the test difference by visual observation and grayscale image processing software Image J. Fecal occult blood detection of consecutive weeks clinical specimens was measured using three dilutes, calculated the difference of positive rate. ResultsGrey level of saline group with whole blood detection was significantly higher than the other two groups, P <0.05, however deionized water and tap water group showed no statistically significant difference, P>0.05. Grey ratio of saline/deionized water was 1.78 ± 0.85, saline/tap water was 2.12 ± 0.72, tap water/deionized water was 0.80 ± 0.05. Conclusion Saline is the most suitable dilutions for fecal occult blood test with a high positive rate compared to other diluents. The results suggest that we should use saline diluent and avoid tap water diluent at work.

The effect of different dilutions on immune chromatography fecal occult blood test

YAO Xiaobin, WANG Dan, MA Weiguo, CAO Weijuan, SHENG Jiahe

(DepartmentofClinicalLaboratory,HenanTumorHospital|AffiliatedTumorHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou,Henan450008,China)

Key words: Saline; Deionized water; Tap water; Fecal occult blood test

糞便隱血試驗(yàn)(facal occult blood test，F(xiàn)OBT)主要用于消化道出血、消化道腫瘤的篩查和鑒別診斷，也可輔助判斷消化道炎癥、潰瘍、結(jié)核等病變。免疫法和化學(xué)法糞便隱血試驗(yàn)的方法學(xué)原理和評(píng)價(jià)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)教材和全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程中均有詳細(xì)解析[1-2]，但是糞便稀釋這一關(guān)鍵步驟均未作說明。糞便隱血試驗(yàn)免疫層析法是檢測(cè)糞便中的游離血紅蛋白，所以在產(chǎn)品設(shè)計(jì)和驗(yàn)證時(shí)均采用蒸餾水或去離子水作為樣本稀釋液[3-4],文獻(xiàn)[5-6]報(bào)道在實(shí)驗(yàn)操作時(shí)常用生理鹽水作為樣本稀釋液,日常工作中也有部分使用自來水作為樣本的稀釋液，認(rèn)為自來水有助于紅細(xì)胞破裂，可以充分釋放細(xì)胞內(nèi)的血紅蛋白，更利于消化道出血的檢出。本文就3種稀釋液是否影響隱血試驗(yàn)結(jié)果的判讀及檢測(cè)的差異如何進(jìn)行驗(yàn)證和討論。

1材料和方法

1.1　全血倍比稀釋樣本潛血檢測(cè)

新鮮全血紅細(xì)胞，能夠定量計(jì)數(shù)，用于評(píng)估商用潛血試紙條檢測(cè)限，并選取合適濃度用于比較不同稀釋液結(jié)果差異。采集 2 mL EDTA-K2抗凝全血，邁瑞B(yǎng)C-5500血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)，選取紅細(xì)胞數(shù)值介于(4~5)×1012、血紅蛋白值介于120~140 g/L之間的樣本?？鼓?jīng)生理鹽水、去離子水、自來水 3 種稀釋液 104、105、106倍稀釋后用于隱血檢測(cè)。

1.2　稀釋和計(jì)數(shù)

微量移液器取 100 μL 全血，加入到 900 μL 稀釋液中，充分吹打、顛倒混勻，依次稀釋 104、105、106倍。不同稀釋倍數(shù)均用改良牛鮑計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)紅細(xì)胞數(shù)值，用于驗(yàn)證稀釋倍數(shù)，誤差不超過10%。隱血試驗(yàn)為免疫層析法，使用商用試劑盒，按說明書要求操作。5 min 后判讀結(jié)果并相機(jī)照相。本實(shí)驗(yàn)樣本例數(shù)為 6 例不同人血液，每例重復(fù)檢測(cè) 3 次。

1.3　臨床糞便標(biāo)本潛血檢測(cè)

連續(xù)2周收集臨床各科送檢的糞便常規(guī)標(biāo)本 314 份，包括性狀正常和異常標(biāo)本。挑取相同部位和量的糞便，置含不同稀釋液的樣本稀釋杯，充分混勻。潛血檢測(cè)步驟同全血稀釋樣本潛血檢測(cè)，試紙條出現(xiàn)肉眼可見的檢測(cè)帶即為陽性。

1.4　數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)

全血檢測(cè)結(jié)果拍照，用Image J圖像處理軟件進(jìn)行灰度分析，記錄灰度值，并計(jì)算生理鹽水/去離子水、生理鹽水/自來水、自來水/去離子水的灰度比值。灰度值比較采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析。臨床糞便潛血檢測(cè)結(jié)果比較則采用卡方檢驗(yàn)進(jìn)行差異分析。

2結(jié)果

2.1　全血稀釋樣本檢測(cè)肉眼觀察結(jié)果比較

3種不同稀釋液 104倍數(shù)稀釋樣本均可見明顯陽性帶;105倍數(shù)稀釋樣本生理鹽水組陽性帶隱約可見，去離子水組和自來水組陽性帶模糊不清;106倍數(shù)稀釋樣本陽性帶均未顯示。故以 104倍數(shù)稀釋作為 3 種稀釋液檢測(cè)結(jié)果比較濃度。結(jié)果見圖 1。測(cè)試條帶均用Image J圖像處理軟件進(jìn)行灰度分析，記錄灰度值。生理鹽水/去離子水灰度比為 1.78±0.85，生理鹽水/自來水灰度比為 2.12±0.72，自來水/去離子水灰度比為 0.80±0.05。生理鹽水組灰度明顯高于其他 2 組，P<0.05；自來水組和去離子水組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。見圖 2。

2.2　臨床糞便標(biāo)本潛血檢測(cè)結(jié)果

連續(xù)2周收集臨床各科送檢的糞便常規(guī)標(biāo)本共 314 份，生理鹽水組陽性率 23.45%，去離子水組陽性率 15.82%，自來水組陽性率 13.39%。生理鹽水組陽性而去離子水或自來水組陰性的標(biāo)本延長(zhǎng)結(jié)果觀測(cè)時(shí)間至 10 min 以上，結(jié)果仍為陰性。生理鹽水組陽性檢出率高于去離子水組，X2=16.24，P<0.01，高于自來水組，X2=17.31，P<0.01；去離子水組和生理鹽水組比較，X2=4.39，P>0.05，2組潛血結(jié)果差異不明顯。

3討論

免疫層析法糞便隱血試驗(yàn)具有靈敏度高、特異性好、簡(jiǎn)便快速、試劑成本低等優(yōu)點(diǎn)，臨床應(yīng)用廣泛。但糞便存在體內(nèi)和體外的 2 次稀釋作用，即消化道出血后的血紅蛋白首先有糞便的體內(nèi)混勻稀釋，操作時(shí)又存在取樣稀釋，2 次稀釋會(huì)明顯降低待檢時(shí)的樣本血紅蛋白濃度，從而出現(xiàn)患者有消化道出血癥狀而潛血檢測(cè)結(jié)果為陰性的可能。

我們的實(shí)驗(yàn)對(duì)全血稀釋后潛血檢測(cè)結(jié)果拍照取圖，并用Image J圖像處理軟件進(jìn)行灰度分析，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有量化的可比性[7]。結(jié)果顯示， 3 種稀釋液 104倍數(shù)稀釋全血均可見明顯陽性條帶，條帶的顏色深淺具有較好的可比性。肉眼觀察生理鹽水陽性條帶較去離子水和自來水明顯，灰度比定量說明生理鹽水稀釋后血紅蛋白濃度是去離子水的 1.78 倍，是自來水的 2.12 倍。去離子水和自來水稀釋結(jié)果無明顯差異。臨床收集的糞便標(biāo)本潛血檢測(cè)結(jié)果顯示，生理鹽水組陽性率明顯高于其他 2 組，去離子水稀釋和自來水稀釋 2 組差異不明顯。從肉眼觀察和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析認(rèn)為，生理鹽水稀釋后檢測(cè)靈敏度高，顯色條帶穩(wěn)定且明顯，利于觀察結(jié)果。雖然去離子水和自來水為低滲介質(zhì)，能夠破壞紅細(xì)胞膜，促使血紅蛋白溢出，但是數(shù)據(jù)顯示并未增強(qiáng)陽性顯示，反而弱于生理鹽水陽性條帶。應(yīng)考慮到生理鹽水具有一定的離子強(qiáng)度和穩(wěn)定的pH，為抗原抗體反應(yīng)提供穩(wěn)定的反應(yīng)環(huán)境[8]；自來水含有消毒成分和較高含量重金屬[9]，不利于抗原抗體的結(jié)合；去離子水或蒸餾水缺乏抗原抗體反應(yīng)的離子介質(zhì)，兩者均不利于抗原抗體穩(wěn)定結(jié)合，并順利遷移至反應(yīng)區(qū)和質(zhì)控區(qū)。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，滴入稀釋后的血液，部分樣本自來水先出現(xiàn)陽性條帶，顏色較生理鹽水和去離子水明顯，但隨時(shí)間延長(zhǎng)超過 5 min 后，生理鹽水陽性條帶清晰度反而超過其他二者。可能為自來水中同時(shí)含有促進(jìn)和抑制抗原抗體反應(yīng)成分，形成的血紅蛋白膠體金結(jié)合物非均勻遷移至陽性帶。3種稀釋液 104倍數(shù)稀釋樣本均能見明顯檢測(cè)帶，105倍數(shù)稀釋樣本生理鹽水組陽性帶可見，去離子水組和自來水組陽性條帶模糊不清，肉眼不可辨，故以此稀釋濃度作為最高稀釋濃度，計(jì)算所用商品試紙條本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)限。我們的試驗(yàn)采用倍比稀釋，稀釋過程充分混勻，稀釋后濃度均用改良牛鮑計(jì)數(shù)板驗(yàn)證，稀釋誤差不超過 10%。商品試紙條本實(shí)驗(yàn)室隱血檢測(cè)最低濃度約 1 mg/L。

有文獻(xiàn)[10-12]認(rèn)為免疫法對(duì)上消化道出血不敏感，可能干擾實(shí)驗(yàn)的因素包括胃液酸性介質(zhì)和消化酶的作用，在工作中存在的稀釋因素，這些都減低了隱血的檢出率，即降低了檢測(cè)的靈敏度。因免疫法干擾因素少，特異性較好，實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)限低于試劑理想限度，所以作者認(rèn)為應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)觀測(cè)時(shí)間，建議糞便隱血試驗(yàn)反應(yīng)時(shí)間應(yīng)大于 5 min，控制在 5~10 min。

綜上所述，我們的試驗(yàn)用Image J圖像處理軟件進(jìn)行灰度分析，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有量化的可比性。數(shù)據(jù)表明，糞便隱血試驗(yàn)最適稀釋液為生理鹽水，不建議使用去離子水或自來水，結(jié)果觀察時(shí)間宜控制在 5~10 min。

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[責(zé)任編輯姬荷]