消栓通絡(luò)有效成分組對腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)保護作用

龐曉斌，王　琳，趙　艷，陳若蕓，謝欣梅，杜冠華*

(1. 河南大學 藥物研究所，河南 開封 475004；2. 青島市市立醫(yī)院，山東 青島 266011；3. 中國醫(yī)學科學院&北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所 國家藥物篩選中心，北京 100050)

消栓通絡(luò)有效成分組對腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)保護作用

龐曉斌1，王琳1，趙艷2，陳若蕓3，謝欣梅1，杜冠華3*

(1. 河南大學 藥物研究所，河南 開封 475004；2. 青島市市立醫(yī)院，山東 青島 266011；3. 中國醫(yī)學科學院&北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所 國家藥物篩選中心，北京 100050)

摘要：目的探討消栓通絡(luò)有效成分組(XECG)對腦缺血/再灌注大鼠的神經(jīng)保護作用。方法采用線栓法阻斷大腦中動脈(MCAO)建立大鼠腦缺血/再灌注(I/R)模型。缺血2 h，再灌注24 h時后，通過腹腔給予XECG(200、100、50 mg·kg-1) ，以腦梗死體積、腦含水量和伊文思藍 (Evans Blue，EB) 法檢測血腦屏障通透性等指標評價XECG對腦缺血的神經(jīng)保護作用。結(jié)果XECG能顯著降低缺血再灌注大鼠腦梗塞體積和血腦屏障通透性。結(jié)論XECG對腦缺血損傷有直接的神經(jīng)保護作用。

關(guān)鍵詞：XECG；腦缺血；梗死體積；血腦屏障

中圖分類號：R743.3

文獻標識碼：A

文章編號：編號： 1672-7606(2015)01-0010-03

收稿日期：2014-09-12

基金項目：國家自然科學基金資助項目 (81273652)。

作者簡介：龐曉斌(1973-)，男，河南洛陽人，博士，副教授，從事藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機制研究工作。

通訊作者：*杜冠華(1956-)，男，山東滕州人，研究員，博士生導師，從事藥物發(fā)現(xiàn)的理論和技術(shù)研究工作。

Abstract:ObjectiveTo investigate the protective effect of effective components group of Xiaoshuantongluo(XECG) on ischemia/reperfusion (I/R) injury in rats. MethodsMiddle cerebral artery occlusion was adopted to establish the rat ischemia / reperfusion model. Healthy male adult Sprague Dawley rats were randomly divided into the sham operation group，the model group，the nimodipine (4 mg·kg-1) group, and high, middle and low dose XECG groups (200, 100, 50 mg·kg-1). Cerebral infarction volume and blood brain barrier permeability were respectively detected by TTC method and Evans Blue (EB) leakage. ResultsCompared with the I/R model group, XECG could significantly reduce the cerebral infarction volume and remarkably decreased blood brain barrier permeability. Conclusion XECG has obviously protective effect on Sprague Dawley rats after cerebral ischemia and reperfusion.

Protective effects of effective components group of Xiaoshuantongluo on cerebral ischemia/reperfusion injury in rats

PANG Xiaobin1, WANG Lin1, ZHAO Yan2, CHEN Ruoyun3, XIE Xinmei1, DU Guanhua3*

(1.InstituteofPharmacy,HenanUniversity,Kaifeng,Henan475004,China；2.QingdaoMunicipalHospital,Qingdao,Shandong266011,China；3NationalCentreforPharmaceuticalScreening,InstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China)

Key words: XECG; cerebral ischemia; infarction volume; blood brain barrier

腦缺血(中風)是臨床常見病，具有高發(fā)病率、高死亡率及高致殘率的特點，嚴重危害著人類健康[1,2]。迄今為止，國內(nèi)外在治療腦缺血及其后遺癥方面還缺少有效的治療藥物。因此, 尋找有效治療藥物具有重大意義。中醫(yī)藥對缺血性腦卒中的治療有一定優(yōu)勢。消栓通絡(luò)方是中醫(yī)用于治療中風后遺癥的常用方劑，由川芎、丹參、黃芪、澤瀉、三七等11味中藥根據(jù)中醫(yī)藥理論配伍而成，具有活血化瘀、溫經(jīng)通絡(luò)之功效[3,4]。消栓通絡(luò)有效成分組 (the effective components group of Xiaoshuantongluo, XECG) 是從消栓通絡(luò)方中經(jīng)分離提取獲得的多種有效成分組合，具有抑制血栓形成、改善腦血流、抑制血管內(nèi)皮細胞損傷等功能[5-7]，但其對急性缺血性腦損傷的保護作用及其機制的研究還少有報道。本實驗采用大腦中動脈內(nèi)線栓法( middle cerebral artery occlusion，MCAO)建立大鼠腦缺血再灌注(ischemia / reperfusion，I/R)模型[8,9]，模擬人類缺血性腦中風病理過程，以腦梗死體積、腦含水量以及藥物對血腦屏障(BBB)通透性的影響等指標評價XECG對腦缺血的神經(jīng)保護作用。以期為XECG用于臨床治療缺血性腦中風提供實驗依據(jù)。

1實驗材料

1.1　實驗動物

成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，SPF級，體質(zhì)量280～300 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，許可證號 SCXY( 京) 2012-0007。實驗過程中大鼠的飼養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定，室溫(25±2) ℃，相對濕度(55±5) %，燈光控制12 h晝夜交替。對實驗動物的所有操作均符合中國實驗動物倫理學的要求。

1.2　藥物與試劑

消栓通絡(luò)有效成分組(XECG)(中國醫(yī)學科學院藥物研究所陳若蕓研究員提供)；尼莫地平片(山西亞寶藥業(yè)集團股份有限公司，批號 100702)；氯化-2，3，5-三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)，伊文氏蘭 (EvansBlue，EB)購自Sigma 公司。

1.3　主要儀器

顯微鏡 SZX16型 ( 日本 Olympus 公司)；冰凍切片機(萊卡，德國)。

2方法

2.1　實驗動物分組及處理

成年健康雄性SD大鼠，隨機分為假手術(shù)組、缺血再灌注模型組、尼莫地平給藥組(4 mg·kg-1)、XECG高、中、低劑量組(200，100，50mg·kg-1)，每組10只。各組手術(shù)后通過腹腔給藥方式給藥，假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水。

2.2　大腦MCAO法建立大鼠腦缺血/再灌注(I /R )模型

SD大鼠術(shù)前12 h禁食，質(zhì)量分數(shù)為10%水合氯醛(350 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，仰臥位固定。參照Longa等[10]的大腦中動脈線栓法，造成左側(cè)大腦中動脈阻塞。缺血2 h后，將栓線向外拉出至頸內(nèi)實現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組只進行術(shù)前麻醉和血管分離術(shù)，不結(jié)扎及導入線栓。

2.3　腦梗死體積的測定

各組取再灌注24 h后的大鼠3只，以質(zhì)量分數(shù)為10%水合氯醛 (350 mg·kg-1體重)行腹腔注射麻醉，開胸暴露心臟，經(jīng)心臟灌流生理鹽水固定。斷頭取腦，迅速將取出的腦組織置于-20 ℃冰箱，10 min后置室溫環(huán)境，將腦從額極至枕葉連續(xù)冠狀切面，厚約2 mm，共5層。然后迅速將腦片置于5 mL體積分數(shù)為2 % 的TTC溶液中，37 ℃恒溫、避光孵育 30 min，然后置于體積分數(shù)為4%多聚甲醛溶液，4 ℃固定，數(shù)碼相機拍照，應用圖像分析系統(tǒng)軟件處理計算腦梗死體積。經(jīng)TTC染色后，正常組織呈玫瑰紅色，梗死組織未被染色而呈白色。

2.4　大腦含水量測定

于再灌注24 h后將大鼠斷頭取腦，將左右腦分別置于預先稱重的試管中，稱取大腦濕重，110℃ 恒溫烘干箱中烘烤72 h，稱干重，按下述公式計算腦水含量：腦含水量(% )=(濕重-干重)/濕重×100%。

2.5　血腦屏障通透性檢測

各組取大鼠3只，手術(shù)后(給藥后)即刻由尾靜脈注射體積分數(shù)為2%伊文思藍(EB)2 mL。再灌注24 h后，快速打開胸腔并暴露心臟，從左心室灌注生理鹽水直至流出無色液體，斷頭取腦，小心剝?nèi)∮覀?cè)大腦半球，電子天平精確稱量其濕重后，加入甲酰胺，于45 ℃的水浴箱孵育24 h，3000 r·min-1離心15 min，取上清液，于620 nm處測定吸光度。根據(jù)EB溶液標準曲線，計算EB的含量(μg·g-1腦重量)。

2.6　統(tǒng)計學方法

3結(jié)果

3.1　XECG對腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積的影響

結(jié)果顯示，腦缺血2 h再灌注24 h后，假手術(shù)組無腦梗死出現(xiàn)，模型組的腦梗死明顯；與模型組相比，XECG各劑量組腦梗死體積明顯縮小，見圖1。

3.2　XECG對大鼠缺血側(cè)腦組織含水量的影響

結(jié)果顯示，模型組大鼠的腦含水量明顯高于假手術(shù)組，差異極顯著(P<0.01)。與模型組相比，XECG各劑量組及尼莫地平組均能夠降低缺血大鼠的大腦含水量，XECG高、中劑量組與模型組相比，差異

顯著，有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1　XECG對缺血大鼠的腦水含量的影響

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05。

3.3　XECG對大鼠缺血側(cè)腦組織血腦屏障通透性的影響

結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠腦組織EB含量明顯升高，差異顯著(P<0.01)；與模型組相比，XECG各給藥組大鼠腦組織EB含量明顯降低,以XECG高劑量組減低最為顯著(P<0.01)，見圖2。

圖2　XECG對腦缺血再灌注大鼠腦組織血腦屏障通透性的影響(±s，n=3)與假手術(shù)組、模型組比較**P<0.01；#P<0.05，##P<0.01。

4討論

消栓通絡(luò)方出自北京同仁堂傳統(tǒng)秘方，是中醫(yī)用于治療中風后遺癥的常用方劑。消栓通絡(luò)有效成分組 (XECG) 是根據(jù)中藥復方有效成分組學思想指導，從消栓通絡(luò)方中經(jīng)分離提取獲得的多種有效成分組合[11]。本研究采用大腦中動脈內(nèi)線栓法建立大鼠局灶性腦缺血模型，通過測定腦梗塞體積、腦含水量，考察了XECG對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用，研究結(jié)果顯示，XECG可顯著減小腦梗死體積，減輕神經(jīng)功能的損傷，并減輕腦水腫。

血腦屏障(BBB)介于血液與腦組織之間，是調(diào)控外周循環(huán)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間物質(zhì)平衡的一道屏障，在生理情況下，BBB能阻止大多數(shù)化合物從血液進入腦組織，因此，BBB在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面具有重要作用[12,13]。在腦缺血時，BBB的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，屏障作用受損，通透性增加，生理狀態(tài)下不能通透的物質(zhì)可透過BBB到達組織間隙，從而引起腦實質(zhì)的進一步損傷和腦水腫[14,15]。了解BBB通透性的調(diào)控方法對于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預防和治療具有重要意義。通過尾靜脈注射伊文氏蘭(EB)，定量檢測染料的滲出率的方法考察了XECG對BBB通透性的影響。結(jié)果表明，XECG各劑量組顯著減少了染料的滲出率(P<0.05，P<0.01)。

終上所述，XECG對腦缺血大鼠具有明確的神經(jīng)保護作用，該保護作用可能與其減輕BBB損傷的作用密切相關(guān)。關(guān)于XECG對BBB的作用機制我們將做進一步的研究探討。

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[責任編輯段金卯]