小菜蛾顆粒體病毒PP31蛋白的原核表達及多克隆抗體制備

王思民 張鴻杰 黎路林

小菜蛾顆粒體病毒（Plutella xylostella granulosis virus，PlxyGV）屬于桿狀病毒科、β-桿狀病毒屬，是一類特異性感染小菜蛾的病毒。其宿主小菜蛾（Plutella xylostella）屬于鱗翅目菜蛾科，對十字花科植物具有較大的危害，嚴重影響甘藍、花椰菜、白菜、油菜、芥菜及蘿卜等十字花科蔬菜的生產。PlxyGV對小菜蛾有高度致病性，其制劑已被應用于小菜蛾的防治，具有殺蟲持續(xù)時間長、無生物安全隱患、不易產生抗藥性等優(yōu)點。

PlxyGV基因組為單一雙鏈環(huán)狀DNA，大小約為101 kb，G+C含量為41％，預測有120個開放閱讀框（Open reading frame，ORF）。其中有74個基因與桿狀病毒代表種苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus AcMNPV）基因具有同源性，pp31基因是其中的一個［1］。pp31基因存在于已完成測序的所有鱗翅目桿狀病毒基因組中。AcMNPV pp31基因的編碼產物是一種磷酸化的DNA結合蛋白，可以非特異性地與DNA結合［2，3］。AcMNPV PP31蛋白具有至少 4個磷酸化位點，其中3個已經確定，其磷酸化由宿主激酶和病毒編碼（或誘導）的激酶催化［4］，但目前尚不清楚哪種宿主激酶作用于PP31。在受感染細胞中，AcMNPV PP31定位于病毒發(fā)生基質，占核蛋白總量的5％［3］。在瞬時表達試驗中，如果不包含pp31基因，晚期報告基因的表達水平會下降90％-98％［5，6］，因此將其歸類于桿狀病毒晚期表達因子。然而，最新的研究顯示，從AcMNPV基因組中敲除pp31基因后，缺失pp31基因的AcMNPV突變體在Sf9細胞中仍然能夠進行復制，但病毒滴度降低；pp31基因的缺失導致99個病毒基因轉錄水平下降［7］。關于PP31蛋白在病毒復制過程中的功能還不清楚。

PlxyGV pp31的預期編碼產物是一個由252個氨基酸殘基組成的多肽，與AcMNPV PP31的序列相同度僅13％［1］。本實驗室之前的研究發(fā)現(xiàn)，PlxyGV PP31蛋白可以與宿主細胞的細胞激酶C受體（RACK）以及甲硫氨酰氨肽酶2（MetAP2）發(fā)生相互作用［8］。本研究對PlxyGV PP31蛋白進行原核表達，制備PlxyGV PP31多克隆抗體，以期為進一步研究PlxyGV PP31的分子生物學特征和功能屬性之用。

1 材料與方法

1.1 材料

pET28a 載 體 以 及 E.coli菌 株 BL21（DE3）、DH5α均為本實驗室保存。限制性內切酶均購自Fermentas公司，T4連接酶為TaKaRa公司產品，蛋白純化使用的ProBondTMResin購買自Invitrogen公司。多克隆抗體制備所使用的新西蘭大白兔由中國科學院武漢病毒所提供。

1.2 方法

1.2.1 PlxyGV pp31基因的克隆 根據(jù)PlxyGV全基因組序列設計pp31基因（36120-36878 nt）引物進行PCR擴增。上游引物：5'-CTGCCATGGATACTGCCGAAAGCGT-3'； 下 游 引 物：5'-AGCGGTCGACATCAGATTTTATTAAATCGC -3'。下劃線標注的為限制性內切酶酶切位點，上下游引物分別為NcoⅠ和SalⅠ。上游引物中，pp31基因第二個密碼子第一個堿基由“T”改為“G”。為了使pp31基因3'端融合的6×His標簽序列可以表達，設計下游引物時去掉了基因的終止密碼“TAA”。使用上述引物，以PlxyGV DNA為模板進行PCR擴增，所得產物用1％的瓊脂糖凝膠電泳分離并進行回收純化。

1.2.2 重組表達質粒的構建 用NcoⅠ和SalⅠ雙酶切回收的pp31基因片段以及pET28a載體；回收酶切后產物，用T4連接酶在16℃水浴連接過夜；將連接產物轉化至DH5α菌株并篩選陽性克隆，獲取重組表達質粒pET28a-pp31。

1.2.3 融合蛋白誘導表達 將重組表達質粒pET28app31轉化至BL21（DE3）菌株中，挑取單菌落至3mL LB中，37℃、250r/min搖菌過夜；取200 μL過夜搖菌菌液至20mL LB中，37℃、250r/min搖菌至OD600到達到0.6；菌液于冰上放置15min后，加入100mg/mL的IPTG至終濃度為1mmol/L，37℃、250r/min誘導表達；分別在誘導3h以及8h時取1mL菌液；8000r/min離心5min集菌；去上清，用50 μLddH2O懸浮菌體，加相應蛋白上樣緩沖液，沸水中煮10min；12000r/min離心10min；取上清進行SDS-PAGE電泳分析。

1.2.4 融合蛋白的大量表達及純化 挑取一個含有pET28a-pp31重組表達質粒的BL21（DE3）單菌落于10mL LB培養(yǎng)基中，37℃、250r/min搖菌過夜；取3mL過夜搖菌菌液至200mL LB培養(yǎng)基中，37℃、250r/min搖菌至OD600到達到0.6；取出菌液，冰上靜置15min；加IPTG（100mg/mL）至終濃度為 1mmol/L，37℃、250r/min誘導 3h；將菌液富集至50mL離心管中，使用Invitrogen公司ProBondTM樹脂進行非變性純化。

用20mL預冷的裂解緩沖液（300mmol/L NaCl；50mmol/L NaH2PO4；10mmol/L咪唑）重懸菌體，加入200 μL 100mmol/L的PMSF后，高壓破碎菌體；10000×g、4℃離心10min；上清轉移至干凈的50mL離心管中，加入200 μL ProBondTM樹脂，水平搖床上冰浴輕搖孵育1h；將孵育好的溶液過重力柱，收集少量流出液，記為FT；用預冷的漂洗緩沖液Ⅰ（300mmol/L NaCl；50mmol/L NaH2PO4；20mmol/L咪唑）洗柱，收集開始和最后的少量流出液，分別記為W1和W2；用預冷的漂洗緩沖液Ⅱ（300mmol/L NaCl；50mmol/L NaH2PO4；40mmol/L咪唑）洗柱，收集少量流出液，記為W3；用預冷的漂洗緩沖液 Ⅲ（300mmol/L NaCl；50mmol/L NaH2PO4；60mmol/L咪唑）洗柱，收集最后的少量流出液，記為W4；用1mL預冷的洗脫緩沖液（300mmol/L NaCl；50mmol/L NaH2PO4；250mmol/L咪唑）洗脫目的蛋白，記為E1；再取0.5mL預冷的洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，記為E2；各取15 μL樣品，加入相應蛋白上樣緩沖液后，電泳進行SDS-PAGE電泳。

1.2.5 多克隆抗體制備 試驗所用的免疫動物為新西蘭大白兔。取400-600 μg純化的PP31蛋白，與等體積的弗氏完全佐劑混勻乳化后，在新西蘭大白兔頸部、背部、四肢等部位皮下多點注射進行第一次免疫。兩周后，以等體積弗氏不完全佐劑與PP31蛋白液的混合液注射新西蘭大白兔進行第2次免疫。第2次免疫兩周后以同樣的方法進行第3次免疫。第3次免疫兩周后，頸動脈插管收集血液并分離血清，分裝后 -80℃保存［9，10］。

1.2.6 Western blot檢測抗血清特異性 取純化的PP31蛋白進行SDS-PAGE電泳；電泳完畢后，凝膠中的蛋白在濕轉緩沖液（20mmol/L Tris，190mmol/L 甘氨酸，20％（V/V）甲醇）中轉移至PVDF膜上；將轉好的膜浸入封閉液（含5％（M/V）脫脂奶粉的TBST（10mmol/L Tris；150mmol/L NaCl；0.05％Tween））中，室溫輕搖封閉1h；以制備的抗血清為一抗，用封閉液按1∶15 000稀釋，室溫輕搖孵育2h；棄一抗溶液，TBST洗膜4次，每次室溫輕搖孵育10min；以HRP標記的羊抗兔IgG為二抗，用封閉液按1∶2 500稀釋，室溫輕搖孵育1h；棄二抗溶液，TBST洗膜4次，每次室溫輕搖孵育10min；DAB顯色試劑盒顯色。

2 結果

2.1 PlxyGV pp31基因的克隆及重組表達載體的構建

以PlxyGV全基因組為模板擴增PlxyGV pp31基因，得到一條約750bp條帶（圖1），與預期大小吻合。得到的產物經過純化后，經過NcoⅠ和SalⅠ雙酶切，連接到表達載體pET28a上，構建成pET28a-pp31重組表達質粒（圖2-A）。pET28a-pp31中，pp31基因序列3'端與一段亮氨酸-谷氨酸-6組氨酸編碼序列融合。構建的重組質粒分別使用XbaⅠ單酶切以及NcoⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定（圖2-B），XbaⅠ單酶切應切下約670bp條帶，NcoⅠ、SalⅠ雙酶切應切下約750bp條帶。如圖2-C所示，酶切鑒定結果與預期一致。測序結果也顯示，PlxyGV pp31基因成功插入到了表達載體pET28a上。

圖1 PlxyGV pp31基因PCR產物電泳分析

圖2 重組表達質粒pET28a-pp31結構圖（A）及其酶切驗證結果（B）

2.2 PP31-His融合蛋白的誘導表達及純化

將構建的pET28a-pp31重組表達質粒轉化至E.coli BL21（DE3）表達菌株中，用終濃度為1mmol/L的IPTG于37℃誘導PP31-His融合蛋白表達，分別在誘導3h、8h取菌液檢測融合蛋白表達情況。如圖3所示，相對于未誘導樣品，在誘導3h和8h都得到一條29kD左右的蛋白條帶，說明重組的pp31基因在1mmol/L IPTG誘導3h即獲得了高效的表達。

圖3 PP31-His融合蛋白的表達分析

基于上述結果，使用終濃度為1mmol/L的IPTG，于37℃誘導E.coli BL21（DE3）表達菌株中PP31-His融合蛋白表達3h。使用Invitrogen公司ProBondTMResin對帶有6×His標簽的融合蛋白進行純化。如圖5所示，在破碎細菌后的上清及沉淀中都存在PP31-His融合蛋白，而且在上清中的目的蛋白量明顯大于沉淀中的量。經過BondTMResin親和層析純化得到的主要是約29kD的蛋白條帶，與his-PP31的預期大小相符；另外還有少量微弱的蛋白帶，可能是一些沒有被洗掉的雜蛋白。

圖4 PP31-His的表達、純化

2.3 Western blot檢測抗血清特異性

用純化的PP31-His融合蛋白分3次免疫新西蘭大白兔，第3次免疫兩周后，頸動脈插管收集血液并分離血清。將純化的PP31-His融合蛋白轉至PVDF膜上，以得到的血清為一抗進行Western blot分析，抗體用封閉液按1∶15 000稀釋，結果見圖5，泳道中可以清楚地看到一條較亮且單一的顯色條帶。說明制備的抗體具有較高的特異，其效價達到1∶15 000以上。

圖5 PP31多克隆抗體的Western blot分析

3 討論

pp31基因存在于所有已完成測序的鱗翅目桿狀病毒基因組。AcMNPV pp31編碼一種磷酸化DNA結合蛋白。該蛋白存在于病毒發(fā)生基質，可與DNA非特異性結合［2，3］。在 AcMNPV感染的 Sf細胞中，PP31蛋白高達核蛋白總量的5％［3］。瞬時表達和基因敲除試驗結果顯示pp31與AcMNPV基因表達調節(jié)有關［5-7］。這些研究結果顯示PP31 是一種重要的功能蛋白。對于顆粒體病毒PP31的研究目前鮮見報道。在前期研究工作中，我們發(fā)現(xiàn)PlxyGV PP31蛋白與宿主細胞的細胞激酶C受體（RACK）以及甲硫氨酰氨肽酶2（MetAP2）發(fā)生相互作用［8］。為了進一步開展對PlxyGV PP31的研究，本研究對PlxyGV PP31蛋白進行了原核表達，并制備了多克隆抗體。該抗體可以用于PlxyGV PP31檢測和定位。

利用原核表達蛋白免疫動物獲得特異性抗體是一種有效、方便的方法。本研究中，以PlxyGV全基因組為模板，通過PCR擴增了PlxyGV pp31基因。將該基因片段連接到pET28a載體上。 pET28a在多克隆位點上下游各有一段表達6×His標簽的序列。在克隆過程中去掉了多克隆位點上游的標簽序列，僅保留了下游的6×His標簽序列，即在目的基因3'端融合了一段6×His標簽序列，方便后期蛋白質的純化。pET系統(tǒng)是一種高效的原核表達系統(tǒng)，在IPTG誘導下，T7 RNA聚合酶被激活，啟動目的基因大量表達；而不存在IPTG時，目的基因處于沉默狀態(tài)，不會進行轉錄、翻譯。在終濃度為1mmol/L的IPTG誘導3h后，目的蛋白就有了高效的表達，并且大部分為可溶性狀態(tài)。為了獲得高純度、高濃度的目的蛋白，使用鎳柱純化體系對帶有6×His標簽的融合蛋白進行純化。在純化過程中，開始僅使用了含有20mmol/L咪唑的漂洗液進行漂洗，發(fā)現(xiàn)最后得到的蛋白液中含有較多的雜蛋白，加大漂洗液用量仍然沒有改善。經過多次試驗，使用分別含有20、40、60mmol/L咪唑的3種漂洗緩沖液進行漂洗，大大減少了最終獲得的蛋白液中的雜蛋白。取純化得到的目的蛋白液分3次免疫新西蘭蛋白兔，每次免疫間隔兩周。在免疫注射前，將蛋白液與佐劑混合，以增強抗原免疫原性。最終獲得了多克隆抗血清。Western blot試驗顯示，該血清具有將強的特異性，效價達到1∶15 000。

4 結論

將PlxyGV pp31基因克隆至原核表達載體pET28a在大腸桿菌BL21（DE3）菌株中表達產生分子量為29kD的含組氨酸標簽的融合蛋白。用該融合蛋白制備的PlxyGV PP31特異性兔抗血清兼具高效價和特異性，可以應用于PlxyGV的檢測和基礎研究工作。

［1］Hashimoto Y, Hayakawa T,Ueno Y, et al. Sequence analysis of the Plutella xylostella granulovirus genome［J］. Virology, 2000, 275（2）：358-372.

［2］Guarino LA, Dong W, Xu B, et al. Baculovirus phosphoprotein pp31 is associated with virogenic stroma［J］. J Virol, 1992, 66（12）：7113-7120.

［3］Guarino LA, Mistretta TA, Dong W. DNA binding activity of the baculovirus late expression factor PP31［J］. Virus Res, 2002, 90（1-2）：187-195.

［4］Broussard DR, Guarino LA, Jarvis DL. Dynamic phosphorylation of Autographa californica nuclear polyhedrosis virus pp31［J］. J Virol, 1996, 70（10）：6767-6774.

［5］Lu A, Miller LK. The roles of eighteen baculovirus late expression factor genes in transcription and DNA replication［J］. J Virol,1995, 69（2）：975-982.

［6］Rapp JC, Wilson JA, Miller LK. Nineteen baculovirus open reading frames, including LEF-12, support late gene expression［J］. J Virol, 1998, 72（12）：10197-10206.

［7］Yamagishi J, Burnett ED, Harwood SH, et al. The AcMNPV pp31 gene is not essential for productive AcMNPV replication or late gene transcription but appears to increase levels of most viral transcripts［J］. Virology, 2007, 365（1）：34-47.

［8］黎路林, 劉攀峰, 王思民, 等. 小菜蛾顆粒體病毒PP31與兩種宿主蛋白發(fā)生相互作用［J］. 病毒學報, 2012（1）：15-22.

［9］張凌云, 衛(wèi)靜, 李長江, 等. 擬南芥轉錄因子NF-YC的原核表達及多克隆抗體制備［J］. 生物技術通報, 2012（3）：57-62.

［10］史皆然, 郭曉雅, 師長宏, 等. 沙門菌外膜蛋白D的原核表達及多克隆抗體制備［J］. 生物技術通訊, 2010（4）：497-500.