一株耐鹽好氧反硝化細(xì)菌的分離篩選及鑒定

石小彤 李彥芹 邢國偉 康現(xiàn)江

近年來，生物脫氮在廢水處理中因其高效、管理成本低、無二次污染而成為污水凈化研究的熱點，氮素的去除由硝化和反硝化兩個過程來完成。硝化作用一般在好氧條件下進(jìn)行，傳統(tǒng)認(rèn)為細(xì)菌的反硝化是一個嚴(yán)格的厭氧過程，反硝化作用是硝態(tài)氮或亞硝態(tài)氮被還原成含氮氣體（NO，N2O）及氮氣的過程。反硝化反應(yīng)過程中，可能存在兩種轉(zhuǎn)化途徑，一種為同化反硝化（合成），形成有機(jī)氮化合物，將其轉(zhuǎn)化為菌體的組成部分；另一種為異化反硝化（分解），最終產(chǎn)物是氣態(tài)氮，或者其它氣態(tài)氮氧化物［1］。自 Robertson等［2］首次發(fā)現(xiàn)了好氧反硝化細(xì)菌Thiosphaera pantotroph后，好氧反硝化菌株已在很多報道中出現(xiàn)，如 Pseudomonas aeruginosa［3］、Pseudomonas chloritidismutans［4］、Alcaligenes piechaudii［5］、Bacillus licheniform［6］等。好氧反硝化細(xì)菌的存在使得硝化與反硝化得以在同一個反應(yīng)器里面進(jìn)行，降低運行成本，硝化反應(yīng)的底物可直接成為反硝化反應(yīng)的底物，加速了硝化反應(yīng)的過程，同時反硝化反應(yīng)釋放的OH-會補(bǔ)償硝化反應(yīng)消耗的堿，避免酸性物質(zhì)的積累，維持pH值穩(wěn)定［7］。

目前海水水質(zhì)處理中針對亞硝酸鹽還原的好氧反硝化細(xì)菌相關(guān)報道較少，好氧反硝化細(xì)菌大多是從淡水環(huán)境中分離得來。本試驗在鹽度為33的情況下篩選出一株對硝酸鹽和亞硝酸鹽具有較強(qiáng)反硝化作的菌株，以期為好氧反硝化細(xì)菌在海水水產(chǎn)養(yǎng)殖水質(zhì)改良方面提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 秦皇島對蝦養(yǎng)殖池底泥。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 反硝化富集分離培養(yǎng)基（DM）（g/L）Na2-HPO4·7H2O 7.9，KH2PO41.5，NH4Cl 0.3，KNO32.0，MgSO4·7H2O 0.1，琥珀酸鈉 4.7，NaNO20.5，NaCl 33.0，微量元素溶液2mL［微量元素溶液配方（g/L）：EDTA 50.0，ZnSO42.2，CaCl25.5，MnCl2·4H2O 5.06，F(xiàn)eSO4·7H2O 5.0，CuSO4·5H2O 1.57，（NH4）6-Mo7O24·4H2O 1.1，CoC12·6H2O 1.61，pH7.0-7.5］。

1.1.2.2 初篩培養(yǎng)基（BTB）［8］（g/L）KNO31.0，KH2PO41.0，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.05，CaCl2·2H2O 0.2，瓊脂 15.0，MgSO4·7H2O 1.0，1mL BTB，NaCl 33.0，pH7.0-7.3。

1.1.2.3 細(xì)菌培養(yǎng)基（g/L）牛肉膏3.0，蛋白胨10.0，H2O 1L，NaCl 33.0，pH7.0-7.2。

1.1.2.4 反硝化性能測試培養(yǎng)基（g/L）A：細(xì)菌培養(yǎng)基+ KNO30.5 g；B：細(xì)菌培養(yǎng)基+ NaNO20.5 g。

1.2 方法

1.2.1 分離方法

1.2.1.1 初篩 取活性污泥1 g接種到裝有200mL滅菌的反硝化培養(yǎng)液的錐形瓶中，振蕩使其混勻，錐形瓶用紗布封口，搖床振蕩培養(yǎng)3d，轉(zhuǎn)速為130r/min，如此重復(fù)操作3次，以富集反硝化細(xì)菌。

富集完成后，取菌懸液進(jìn)行BTB平板涂布，30℃溫箱培養(yǎng)2-3d，待菌落長出后，挑取藍(lán)色和藍(lán)色暈圈的單菌落，在固體細(xì)菌培養(yǎng)基上多次劃線純化，直至其有清晰的單菌落，無雜菌和伴生菌，將純化好的菌落轉(zhuǎn)接到試管斜面，溫箱靜置培養(yǎng)3 d后放冰箱4℃保存。

1.2.1.2 復(fù)篩 定性測試：將保存在斜面上的菌株接種到反硝化培養(yǎng)液中，室溫振蕩培養(yǎng)2-3 d。吸取少量菌液，滴加格里斯試劑和二苯胺試劑，進(jìn)行顯色反應(yīng)。將有顯色反應(yīng)的菌株接種到反硝化培養(yǎng)基試管內(nèi)，恒溫培養(yǎng)，觀察德漢氏小管內(nèi)有無氣體。

定量測試：接種斜面菌株于細(xì)菌液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)48h作為種子，以2％的接種量轉(zhuǎn)接到200mL反硝化培養(yǎng)基中，搖床振蕩3 d后，取菌液檢測培養(yǎng)基的總氮含量，并計算總脫氮率，從中篩選出總脫氮率最高的一株菌株。接種該菌株于反硝化性能測試培養(yǎng)基A和B，30℃下130r/min振蕩培養(yǎng)，每隔10h檢測硝酸鹽和亞硝酸鹽濃度。

每個試驗重復(fù)3次，每組設(shè)置3個平行，未接種細(xì)菌的滅菌培養(yǎng)液作為空白樣。

1.2.2 分析方法 總氮（TN）采用堿性過硫酸鉀紫外線分光光度法檢測；硝酸氮（NO3--N）用紫外分光光度法檢測；亞硝酸氮（NO2--N）測定用N-（1-萘基）-乙二胺光度法［9］。測定TN時培養(yǎng)液不離心，直接稀釋測定，而測定NO3

--N和NO2--N時，培養(yǎng)液12000r/min離心10min，將菌體去除，取上清測定。

1.2.3 好氧反硝化細(xì)菌的鑒定

1.2.3.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察 取有單菌落的培養(yǎng)皿，拍照得菌落照片，對篩選菌株進(jìn)行革蘭氏染色，將染色后的細(xì)菌于顯微鏡下觀察。

1.2.3.2 菌體生長曲線 吸光度法用721分光光度計在光波長為660nm處測量吸光度值。在溫度為30℃、接種量為2％、120r/min搖床振蕩培養(yǎng)，每隔6h采樣測定菌液OD值。

1.2.3.3 生理生化鑒定 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》［10］。

1.2.3.4 菌株16S rDNA序列分析 將篩選所得菌株保存至斜面送交至北京基諾萊普生物技術(shù)有限公司測序，16S rDNA擴(kuò)增引物：上游為27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），下游引物為1492R（5'-AAGTCGTAACAAGGTAACC-3'），測序結(jié)果通過GenBank Blast進(jìn)行比對分析。

2 結(jié)果

2.1 菌株的篩選

通過對細(xì)菌的富集分離純化及顯色反應(yīng)，篩選得到35株菌株，編號為F1-F35。將這35株菌株接種到裝有德漢氏小管的反硝化培養(yǎng)基試管內(nèi)，2周后有4個菌株內(nèi)的德漢氏小管內(nèi)有氣體。它們分別為F1、F14、F26和F29，說明這4株菌株能較好地降解硝酸鹽和亞硝酸鹽，反硝化過程較為徹底，反硝化作用較強(qiáng)。

圖1為菌株F1、F14、F26和F29的脫氮率，在3 d之內(nèi)它們對培養(yǎng)基中總氮的消解率都達(dá)到了50％以上，沒有接入細(xì)菌的對照反硝化培養(yǎng)液（CK）總氮含量變化很少，這4株菌株中菌株F1的脫氮率最高，達(dá)到71.4％，其余3株分別為51.25％、55％和60.7％。由于TN測定中包含了微生物同化的氮，同時搖床震蕩確保了好氧條件，因此，本研究中總氮的減少主要源于微生物好氧反硝化作用所致，含氮量越低表明菌株降解能力越強(qiáng)，總氮的減少程度即代表了反硝化脫氮的效果。由此得知，菌株F1好氧反硝化脫氮效果最好。

圖1 不同菌株總氮的去除率比較

2.2 菌株的好氧反硝化特性

圖2 A培養(yǎng)基內(nèi)和度變化

圖3 B培養(yǎng)基內(nèi)和度變化

表1 培養(yǎng)基A和B中和濃度變化

表1 培養(yǎng)基A和B中和濃度變化

？

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 菌株形態(tài)學(xué)觀察 菌株F1在細(xì)菌平板上，菌落形態(tài)為圓形，乳白色，邊緣整齊清晰，表面光滑，中心凸起，F(xiàn)1的單細(xì)胞呈短桿狀或桿狀，革蘭氏陰性（圖4）。

圖4 菌株F1光學(xué)及菌落圖

2.3.2 菌株生長曲線 菌株接種到液體細(xì)菌培養(yǎng)基后，細(xì)菌的生長會使澄清的培養(yǎng)液逐漸變渾濁，在特定波長下，菌懸液中的細(xì)菌數(shù)量與相應(yīng)吸光度成正比。細(xì)菌生長曲線一般表現(xiàn)出4個不同的生長時期：遲緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。菌株F1生長曲線，如圖5所示。在好氧條件下，鹽度為33時，菌株F1的遲緩期很短，接種后迅速進(jìn)入對數(shù)生長期，6-24h為菌株F1的指數(shù)生長期，24h后菌體濃度達(dá)到最高，進(jìn)入穩(wěn)定期，48h后隨著培養(yǎng)時間的繼續(xù)延長，細(xì)菌吸光度降低。

圖5 菌株F1的生長曲線

2.3.3 菌株的生理生化鑒定 根據(jù)細(xì)菌菌落及菌體的形態(tài)特征結(jié)合其生理生化試驗（表2），初步推斷菌株F1為鹽單胞菌屬（Halomonas sp.）。

表2 菌株F1的生理生化功能鑒定

2.3.4 序列分析 將所測序列在 NCBI上進(jìn)行Blast序列比對，結(jié)果顯示，菌株F1與Halomonas alimentaria的同源性最高，為99％，登錄號為NR_025054。由此可知，菌株F1屬于鹽單胞菌屬。采用MEGA4.1分析軟件，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖6）。

3 討論

反硝化細(xì)菌在分類學(xué)上并沒有專門的類群，而是分散于原核生物的眾多屬中。好氧反硝化現(xiàn)象僅在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)，主要存在于假單胞菌屬（Pseudomonas）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）、副球菌屬（Paracoccus）和芽孢桿菌屬（Bacillus）等［11］。嗜鹽反硝化細(xì)菌數(shù)量較少，主要分布于細(xì)菌中的Bacillus、Halomonas及古細(xì)菌Halobacterium和Haloarcula等幾個屬中［12］。廖紹安［13］利用間歇曝氣選擇性富集，篩選到一株10h內(nèi)將亞硝態(tài)氮由26.18mg/L降至0的好氧反硝化細(xì)菌，在鹽度為0-25之間20h內(nèi)均可達(dá)到同樣的去除效果。Li［14］發(fā)現(xiàn)菌株GQ-42在鹽度為50-100內(nèi)去除率保持在90％以上；當(dāng)鹽度超過150，隨著鹽度的增大，去除率下降得較為明顯。鹽度對反硝化的活性可能有一定的影響。該試驗分離的菌株F1是一株能利用硝酸鹽和亞硝酸鹽的好氧反硝化菌，經(jīng)過形態(tài)特征、生理生化試驗和16S rDNA序列分析，初步鑒定該菌株屬于鹽單胞菌屬。它與目前所報道的好氧反硝化菌均不相同，表現(xiàn)了自然界中好氧反硝化菌的生物多樣性，對揭示好氧反硝化菌的生態(tài)學(xué)有重要的意義。

圖6 菌株F1的系統(tǒng)發(fā)育樹

從圖2和圖3可以看出，不管氮源是硝酸鹽還是亞硝酸鹽，反硝化主要發(fā)生在0-30h之間。結(jié)合菌株的生長曲線，可以得出，好氧反硝化作用主要發(fā)生在對數(shù)生長期，而遲緩期、穩(wěn)定期和衰亡期和并沒有明顯的濃度變化，說明此期間并沒有明顯的反硝化過程。好氧反硝化作用主要發(fā)生在對數(shù)生長期，這是因為細(xì)菌在此期間生長速率最快，細(xì)胞代謝旺盛，細(xì)胞合成所需要的能量和還原力主要在這一階段被消耗，所以指數(shù)生長期是反硝化效率最高的時期，這與周丹丹等［15］報道的菌株情況相似。

水體中亞硝酸鹽濃度積累到一定程度后，將對水體中養(yǎng)殖的魚蝦類產(chǎn)生毒害，它主要是誘導(dǎo)血液中的血紅蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)楦哞F血紅蛋白，抑制血液載氧能力，出現(xiàn)組織缺氧，甚至導(dǎo)致魚蝦類缺氧窒息而死。一般試驗中反硝化性能測試時常用硝酸鹽為氮源，而該試驗B培養(yǎng)基以為唯一氮源，培養(yǎng)基濃度由初始的32.79mg/L在70h后降低為0.93mg/L，降解率達(dá)到97.16％，此間亞硝態(tài)氮最高脫氮速率可為1.25mg/L·h（0-10h）。

影響反硝化脫氮率的因素有碳源、碳氮比、溶氧量、溫度、pH和初始氮濃度等，接下來將對該菌株在這些方面進(jìn)行研究，得出最佳反硝化條件，為今后實現(xiàn)硝化反硝化工藝的研究提供依據(jù)。

4 結(jié)論

從對蝦養(yǎng)殖池底泥中分離純化得到4株好氧反硝化細(xì)菌，分別為F1、F14、F26和F29，其總氮去除率為71.4％、51.25％、55％和60.7％。菌株 F1在鹽度為33時，能有效降解硝酸鹽和亞硝酸鹽，40h內(nèi)脫氮率達(dá)到86.82％和97.01％，是一株高效的反硝化細(xì)菌，反硝化過程主要發(fā)生在對數(shù)生長期，初步鑒定為鹽單胞菌。

［1］文屹.兩株異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌的分離、篩選、鑒定和特性研究［D］.廣州：華南理工大學(xué), 2010.

［2］Robertson LA, Kuenen JG. Aerobic denitrification：a controversy revived［J］. Arch Microbiol, 1984, 139：351-354.

［3］Chen F, Xia Q, Ju LK. Aerobic denitrification of Pseudomonas aeruginosa monitored by online nad（p）h fluorescence［J］.Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69（11）：6715-6722.

［4］馬放, 周丹丹, 王宏宇, 等.一株好氧反硝化細(xì)菌生理生態(tài)特征的研究［J］.哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2006, 38（4）：575-577.

［5］Pai SL, Chong NM, Chen CH. Potential applications of aerobic denitrifying bacteria as bioagents in wastewater treatment ［J］.Bioresource Technology, 1999, 68（2）：179-185.

［6］Kim JK, Park KJ, Cho KS, et al. Aerobic nitrifcation-denitrifcation by heterotrophic Bacillus strains ［J］. Bioresource Technology,2005, 96（17）：1897-1906.

［7］楊基先, 高珊珊, 馬放, 等.一株好氧反硝化細(xì)菌的分離鑒定及反硝化能力［J］.環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2008, 28（7）：1302-1307.

［8］Takaya N, Maria Antonina BCS, Yasushi S, et al. Aerobic denitrifying bacteria that produce low levels of nitrous oxide ［J］. Applied and Environmental Microbiology, 2003, 69（6）：3152-3157.

［9］國家環(huán)保局編委會.水和廢水監(jiān)測分析方法 ［M］.第3版.北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社, 1989.

［10］東秀珠, 蔡妙英, 等.常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］.北京：科學(xué)出版社, 2001.

［11］王薇, 蔡祖聰, 鐘文輝, 等.好氧反硝化菌的研究進(jìn)展［J］.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報, 2007, 18（11）：2618-2625.

［12］Zumft WG. Cell biology and molecular basis of denitrification ［J］.Microbiol Mol Biol Rev, 1997, 61（4）：533-616.

［13］廖紹安, 鄭桂麗, 王安利, 等.養(yǎng)蝦池好氧反硝化細(xì)菌新菌株的分離鑒定及特征［J］.生態(tài)學(xué)報, 2006, 26（11）：3178-3724.

［14］Li J, Wang W, Liang L, et al. Screening of aerobic denitrifying bacteria with salt tolerance and characteristics of aerobic denitrification［J］. Environmental Science＆Technology, 2011, 34（6）：48-52.

［15］周丹丹, 馬放, 王弘宇, 等.關(guān)于好氧反硝化菌篩選方法的研究［J］.微生物學(xué)報, 2004, 44（6）：837-839.