抗生素耐藥性大腸桿菌外膜蛋白mOmpA N端序列分析

趙志平 聶鑫 李再新 丁杰 張智 謝萬(wàn)如

近年來(lái)，抗生素耐藥大腸桿菌的種類和數(shù)量越來(lái)越多，并且具有抵抗多種抗生素的能力，如紅霉素、喹諾酮類和β-內(nèi)酰胺類抗生素［1，2］。大腸桿菌的抗生素耐藥機(jī)制非常復(fù)雜，主要包括阻礙細(xì)胞壁和核酸合成、抑制蛋白質(zhì)合成、破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)等［3，4］。大腸桿菌外膜蛋白能保護(hù)細(xì)胞免受或減少多種有害物質(zhì)的影響，如抗生素、蛋白酶和毒素等［5］。大腸桿菌外膜蛋白主要包括OmpA、OmpC和OmpF等，在影響抗生素等有害物質(zhì)的通透性方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。其中，OmpA是研究的最為透徹的大腸桿菌外膜蛋白［6］。

1998年，Pautsch 和 Schulz［7］最早通過(guò) X-射線衍射技術(shù)確定了大腸桿菌OmpA的結(jié)構(gòu)，并將研究結(jié)論發(fā)表在Nature Structural Biology雜志上。2001年，Arora等［8］利用核磁共振NMR技術(shù)研究了大腸桿菌OmpA的結(jié)構(gòu)，相關(guān)研究成果也發(fā)表在Nature Structural Biology雜志上。研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌OmpA外膜蛋白含有325個(gè)氨基酸殘基，包括N端和C端兩個(gè)區(qū)域。其中，N端區(qū)域包含171個(gè)氨基酸殘基，包含8個(gè)以β-折疊形勢(shì)存在的跨膜片段［9］。C端包含129個(gè)氨基酸殘基，含有較多的α-螺旋。N端和C端通過(guò)富含Ala-Pro鉸鏈序列相連［10］。

OmpA最早在大腸桿菌K12中被發(fā)現(xiàn)，隨后得到廣泛、深入的研究。OmpA屬于高豐度蛋白，每個(gè)細(xì)胞中含有約105個(gè)拷貝［11］。OmpA對(duì)外膜的結(jié)構(gòu)整合和外膜蛋白的裝配、結(jié)構(gòu)起著決定性作用［12］。OmpA可以作為抗菌素和細(xì)菌噬菌體受體、免疫靶點(diǎn)，并且和大腸桿菌的吸附和侵入密切相關(guān)［13］，在大腸桿菌接合轉(zhuǎn)移和生物膜形成過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用［14］。OmpA N端區(qū)域?qū)τ贠mpA的裝配、結(jié)構(gòu)功能發(fā)揮著重要的作用。目前，尚無(wú)有關(guān)于OmpA N端序列突變的研究報(bào)道。

本研究從抗生素耐藥大腸肝菌中克隆mOmpA基因并構(gòu)建表達(dá)載體pET32a-mOmpA，旨在為進(jìn)一步了解大腸桿菌OmpA的結(jié)構(gòu)功能及大腸桿菌耐藥機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 抗生素（氨芐青霉素、鏈霉素、慶大霉素）耐藥大腸桿菌、DH5α和pET-32a載體為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 主要試劑和限制性內(nèi)切酶 Hind III、EcoR I限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、PCR試劑等購(gòu)自大連寶生物公司。DL2000 plus Marker為美科美（北京）公司產(chǎn)品，高保真Pfu DNA聚合酶購(gòu)自Promega公司，質(zhì)粒DNA抽提試劑盒和DNA過(guò)柱快速純化試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司。

1.2 方法

1.2.1 抗生素耐藥性大腸桿菌的分離 收集經(jīng)病理學(xué)鑒定為大腸桿菌致死的兔子，無(wú)菌解剖，從腸道、肝臟及心臟中采集疑似菌染液，做倍比稀釋。將稀釋液均勻涂布在LB培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)，觀察細(xì)菌的形態(tài)特征。挑取生長(zhǎng)良好的單個(gè)菌落，依次接種于伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基平板和麥康凱培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)，觀察單個(gè)菌落的顏色、形態(tài)。最后挑取符合大腸桿菌形態(tài)特征的單個(gè)菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)14-16h后，涂片、染色、鏡檢，確認(rèn)為純培養(yǎng)物。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank報(bào)道的大腸桿菌OmpA基因序列（ID：7437746）設(shè)計(jì)mOmpA引物。mOmpA-F引物序列為：5'-GAATTCATGAAAAAGACAGCTATCGCG-3'（下劃線為EcoR I限制性酶切位點(diǎn)）。mOmpA-R引物序列為：5'-AAGCTTAGCCTGCGGCTGAGTTACAAC-3'（下劃線為Hind III限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)）。

1.2.3 煮沸法提取革蘭氏陰性細(xì)菌基因組DNA 將分離的抗生素耐藥大腸桿菌菌株劇烈振蕩過(guò)夜培養(yǎng)，取1mL菌液，離心棄上清；用1mL滅菌超純水漂洗2次，離心棄上清。用100μL滅菌超純水重懸，沸水煮6min，冰上放置5min。離心后將上清移入一干凈的1.5mL EP管中，即為總DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 mOmpA的克隆 利用引物mOmpA-F和mOmpA-R從提取的基因組DNA中擴(kuò)增mOmpA。PCR反應(yīng)體系為：10×Pfu buffer 5μL，10μmol/L mOmpA-F引物 2μL，10μmol/L mOmpA-R引物 2μL，dNTP（各10mmol/L）1μL，基因組 DNA 10 ng-1μg，加滅菌超純水至50μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃ 5min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 70s，30個(gè)循環(huán)。mOmpA大小為1100bp。

1.2.5 表達(dá)載體pET32a-mOmpA的構(gòu)建 EcoR I和Hind III酶切mOmpA片段5h，利用過(guò)柱純化試劑盒回收；pET-32a經(jīng)EcoR I和Hind III酶切后用同樣方法純化。取3.5μL雙酶切的mOmpA片段與1.5μL雙酶切的pET-32a于16℃連接過(guò)夜。連接產(chǎn)物加入到100μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰水放置30min后42℃熱激90s，冰水放置2min。加入600μL LB培養(yǎng)基后于37℃孵育1h，取100μL培養(yǎng)液涂布在LB固體培養(yǎng)基（Amp 50μg/mL）上，37℃培養(yǎng)14-16h后進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，PCR引物為mOmpA-F和T7 terminator。取陽(yáng)性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和Hind III酶切驗(yàn)證后寄送深圳華大基因測(cè)序。

1.2.6 mOmpA N端序列分析 利用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序序列進(jìn)行比對(duì)分析，利用Swiss-Model網(wǎng)站預(yù)測(cè)分析OmpA N端蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。

圖1 mOmpA基因片段的PCR擴(kuò)增

2 結(jié)果

2.1 mOmpA的克隆

利用高保真Pfu DNA聚合酶從提取的抗生素耐藥大腸桿菌基因組DNA中擴(kuò)增了mOmpA片段，凝膠電泳得到了1100bp左右的明亮條帶（圖1），初步判斷PCR擴(kuò)增正確。

2.2 表達(dá)載體pET32a-mOmpA的構(gòu)建

EcoR I-Hind III雙酶切的mOmpA片段和pET-32a連接轉(zhuǎn)化后經(jīng)PCR驗(yàn)證獲得陽(yáng)性克隆，如圖2所示。從圖2可以看出，以菌落2和4為模板擴(kuò)增得到了1100bp左右的明亮條帶，100bp處條帶為引物二聚體。為進(jìn)一步驗(yàn)證表達(dá)載體的正確性，經(jīng)培養(yǎng)后提取其質(zhì)粒DNA，EcoR I和Hind III酶切后得到1100bp左右的目標(biāo)片段，如圖3所示。

圖2 表達(dá)載體的菌落PCR驗(yàn)證

圖3 表達(dá)載體的酶切驗(yàn)證

2.3 mOmpA N端DNA序列比對(duì)分析

菌落PCR和EcoR I-Hind III酶切驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒DNA經(jīng)深圳華大基因測(cè)序。將其N端序列與OmpA N端序列進(jìn)行了比對(duì)分析，結(jié)果（圖4）顯示，mOmpA與OmpA N端的同源性為79.93％，發(fā)生了較大程度的突變。mOmpA N端長(zhǎng)度是542bp，而OmpA N端長(zhǎng)度為512bp，并且有兩處發(fā)生明顯突變，分別增加了15bp。

2.4 mOmpA N端氨基酸序列比對(duì)分析

mOmpA N端DNA序列翻譯成氨基酸序列后與OmpA N端序列進(jìn)行了比對(duì)分析，結(jié)果如圖5所示。mOmpA與OmpA N端長(zhǎng)度分別為181和171個(gè)氨基酸殘基，同源性為81.17％，有較多的氨基酸殘基發(fā)生了突變。OmpA N端含有8個(gè)β-折疊區(qū)域，mOmpA此區(qū)域有7個(gè)部位的氨基酸殘基發(fā)生了突變。其中，β1-折疊區(qū)域的Thr30和Ala32分別被Ala30和Gly32所取代。β3-折疊區(qū)域的Vla70、β4-折疊區(qū)域的Tyr93、β5-折疊區(qū)域的Thr127分別被Leu70、Phe93和Ser127所取代。β6-折疊區(qū)域的Asn135和Tyr150分別被Glu135和Trp150所取代。OmpA N端 含 有 4個(gè) loop（L）環(huán)，mOmpA的L1和L3處發(fā)生了明顯變化，分別增加5個(gè)氨基酸殘基，它們分別是L1處的Gly43、Phe44、Tyr45、Gly46和 Asn47；L3處的 Tyr126、Asn127、Ser128、Thr129和Gly130。OmpA N端含有3個(gè)轉(zhuǎn)角（Turn），T1和T2沒(méi)有發(fā)生突變。T3發(fā)生3處突變，Ile152、Pro154和Glu155分別被Val152、Arg154和Asp155所取代。mOmpA N端氨基酸序列，尤其是β-折疊、Loop環(huán)和T轉(zhuǎn)角等重要區(qū)域氨基酸的突變對(duì)其空間結(jié)構(gòu)可能產(chǎn)生一定的影響。

2.5 mOmpA N端空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

鑒于mOmpA的Loop環(huán)和轉(zhuǎn)角等重要區(qū)域發(fā)生突變，為預(yù)測(cè)其空間結(jié)構(gòu)是否發(fā)生變化，使用了Swiss-Model在線工具對(duì)其進(jìn)行了蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖6所示。從圖6可以看出mOmpA的L1、L2、L3和L4環(huán)的方向較OmpA都發(fā)生了明顯的變化。這些變化可能與Loop環(huán)部分氨基酸殘基發(fā)生突變有著密切關(guān)系。

3 討論

圖4 mOmpA和OmpA N端核苷酸序列比對(duì)分析

圖5 OmpA和mOmpA N端氨基酸序列比對(duì)分析

圖6 mOmpA和OmpA N端蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

OmpA是研究膜蛋白結(jié)構(gòu)的模式蛋白，其N端區(qū)域的8個(gè)β-折疊區(qū)在其組裝過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用［7，11］。mOmpA的 5個(gè) β-折疊區(qū)發(fā)生了不同程度的突變，但蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示β-折疊區(qū)的突變并未明顯改變其空間構(gòu)型。mOmpA的T3轉(zhuǎn)角處發(fā)生了3處突變，這3處突變可能與mOmpA的Loop環(huán)的方向發(fā)生了顯著變化有關(guān)。OmpA在大腸桿菌抵御抗生素等有毒物質(zhì)過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用［5］，對(duì)其抵御脅迫條件同樣具有重要的作用［15］。OmpA N端氨基酸的突變是否會(huì)影響其功能以及其形成的膜孔通道還有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。OmpA在致病性大腸桿菌進(jìn)化和抗生素耐藥過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。OmpA是普遍存在于革蘭氏陰性菌表面的蛋白，在細(xì)菌生命活動(dòng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，它可以作為細(xì)菌的黏附素和侵襲素，參與生物膜的形成，也可作為多種噬菌體的受體，是先天免疫系統(tǒng)的重要靶位。因此，外膜蛋白的易突變性加大了致病性大腸桿菌的防治，增加了外膜蛋白疫苗的研制難度。

4 結(jié)論

本研究克隆了mOmpA，序列分析表明mOmpA N端DNA和氨基酸序列均發(fā)生了顯著突變。Swiss-Model分析顯示，mOmpA的N端空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了一定的變化，尤其是Loop環(huán)的方向發(fā)生了顯著變化。

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