7個大穗型小麥-黑麥代換系間雜交后代的形態(tài)學與SSR分析

姜鹿鳴 田超 李集臨 張延明

小麥異代換系是染色體工程常用的基礎(chǔ)材料之一，是指通過染色體工程技術(shù)把攜帶外源優(yōu)良基因的染色體轉(zhuǎn)入小麥遺傳背景，替換小麥中的1條、1對或多條染色體所形成的品系或中間種質(zhì)材料［1，2］。黑麥種質(zhì)資源中有很多有利于小麥改良的優(yōu)良基因，如抗白粉病、抗旱、耐貧瘠、抗銹病等基因，對于小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)都有顯著提高，目前很多研究已將這些黑麥基因成功的應(yīng)用于小麥遺傳改良上。小麥-黑麥代換系遺傳性穩(wěn)定，育性正常，在生產(chǎn)上可以直接利用［3］。1998年，Robinovich等調(diào)查發(fā)現(xiàn)，全世界大約有330多個小麥推廣品種是小麥－黑麥易位系或代換系［4］，如著名的小黑麥Armadillo是2D/2R 代換系［5］。

簡單重復序列（Simple sequence repeat，SSR）又稱微衛(wèi)星（Microsatellite）DNA，是近年來發(fā)展起來的建立在PCR基礎(chǔ)上的第二代分子標記，它是由一類短的串聯(lián)重復序列基序（1-6個核苷酸）組成的簡單重復序列［6］。由于SSR具有高水平的多態(tài)性、易于檢測和共顯性等特點，目前廣泛應(yīng)用在小麥研究中。崔會肖等［7］用20對小麥SSR特異引物，對小麥近緣種和小麥—簇毛麥染色體代換系、易位系的基因組DNA進行了鑒定。

為了加強對黑麥的遺傳及其應(yīng)用研究，進一步發(fā)掘黑麥優(yōu)良基因資源，本研究對從小麥-黑麥代換系5R/5A與1R/1D雜交后代中選育的7個大穗型品系進行形態(tài)學分析與SSR鑒定，以了解這些品系的遺傳基礎(chǔ)及更好地利用其對小麥進行遺傳改良。

1 材料與方法

1.1 材料

母本為小麥-黑麥代換系5R/5A，表現(xiàn)大穗、多小穗、抗病、有頸毛；父本為小麥-黑麥代換系1R/1D，表現(xiàn)大穗、大粒、小穗排列較密、抗旱，由哈爾濱師范大學遺傳實驗室培育并鑒定［5］。小麥-黑麥代換系5R/5A與1R/1D（2n=42）雜交后代材料：1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11共 7個品系，由哈爾濱師范大學遺傳學實驗室創(chuàng)制和提供。中國春（Triticum aestivum cv. Chinese Spring）、黑麥（勝利黑麥）（Secale cereale L.），由哈爾濱師范大學遺傳學實驗室從黑龍江省農(nóng)科院引進并保存。

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學觀察 2012年7-8月于哈爾濱師范大學試驗田對7個品系及親本進行田間統(tǒng)計與觀察，隨機抽取20株。依據(jù)《小麥種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準》［8］對植株性狀進行形態(tài)學觀察與分析，如株高、穗長、分蘗數(shù)、小穗數(shù)、百粒重、抗病性、抗旱性、頸毛和紫莖等。

1.2.2 DNA提取 取葉片放入液氮冷凍并研磨成粉末，采用CTAB法［9］提取小麥總DNA，用純水溶解備用。

1.2.3 SSR 分析 根據(jù)任如意等［10］、Robert 等［11］、Saal等［12］方法合成特異性PCR引物，引物的堿基序列、染色體位置、退火溫度等信息參見文獻［10-12］，合成由大連寶生物公司完成，本試驗使用的引物序列，見表1。

反應(yīng)體系：5μL，1×PCR buffer，1.5mmol Mg-Cl2，200μmol/L dNTP，0.5U Taq 酶，40 ng 引物，40-60 ng 模板DNA。擴增產(chǎn)物經(jīng)15％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染法染色并照相。

PCR程序：95℃ 3min 預變性；95℃變性30s，55℃或57℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)30次；72℃延伸10min。

表1 PCR特異擴增引物

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學觀察

7個品系的形態(tài)學觀察結(jié)果表明，植株遺傳性穩(wěn)定，具有1R/1D的小穗排列整齊、抗條銹病、葉銹病、桿銹病；5R/5A的長穗、多小穗、有頸毛等形態(tài)特點。7個品系均屬于大穗型材料，穗長超過14cm，其中1-8品系可達17.0cm，1-11品系穗長達到17.5cm，7個品系的小穗數(shù)均超過20個，1-8達到24個，主要性狀及穗型，如表2和圖1所示。

表2 7個品系及親本的田間性狀

圖1 7個品系及其親本的穗形圖

2.2 DNA檢測

經(jīng)電泳和紫外分光光度計檢測試驗材料DNA，電泳條帶都較明顯清晰，DNA質(zhì)量較好。測量OD260/ OD280的比值均接近1.8，提取的DNA能應(yīng)用SSR-PCR分析（圖2）。

圖2 DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.3 分子標記分析

用篩選出的引物分析7個品系，結(jié)果（圖3）表明，有1對引物PSC119.1可以在黑麥和7個品系中擴增出一條長約750bp的特異帶，而在中國春中沒有結(jié)合位點，不能擴增出特征帶。說明檢測的植株中具有黑麥R染色體組成分。

圖3 引物PSC119.1擴增結(jié)果

引物 SCM138-5RS，在 1-6、1-7、1-8、1-9、1-10和黑麥中擴增出約188bp黑麥特異片段（圖4中箭頭所示），該片段在中國春、1-5與1-11中未出現(xiàn)，表明1-6、1-7、1-8、1-9、1-10中導入了黑麥5R染色體短臂遺傳物質(zhì)。引物SCM120-5RL在黑麥中擴增出100-150bp4條清晰條帶（圖5）。但考慮到marker分布不均等情況，圖4中箭頭所示位置約為127bp，在此位置7個品系均擴增出特異條帶，而中國春未出現(xiàn)條帶，從而表明7個品系中導入了黑麥5R染色體長臂遺傳物質(zhì)。引物TSM604-1RS可以在黑麥和7個品系中穩(wěn)定地擴增出一條長約115bp的特異帶（圖6），而在中國春中無擴增帶紋，表明7個品系中有來自黑麥1R染色體短臂的遺傳物質(zhì)，該引物TSM604-1RS（115bp）可作為識別7個品系的特異標記。

圖4 引物SCM138-5RS擴增結(jié)果

圖5 引物SCM120-5RL擴增結(jié)果

圖6 引物TSM604-1RS擴增結(jié)果

3 討論

通過代換系間雜交將近緣種屬的有益基因?qū)胄←?，是小麥改良的有效途徑之一。在供試材料品系小?黑麥代換系5R/5A與1R/1D雜交的高代品系中，有的可以直接被觀察到兼具雙親性狀，例如，1R/1D的小穗排列整齊、抗條銹病、葉銹病、桿銹??；5R/5A的穗長、有莖毛、穗疏等。但是，一些性狀是由多個基因共同控制，容易受外界環(huán)境的干擾，同時由于基因的表達會有一定差異，所以依靠表型所做的標記只能初步鑒定導入了外源遺傳物質(zhì)。

目前，SSR技術(shù)已經(jīng)成為小麥最為常用和高效的分子標記系統(tǒng)。Iqbal等［13］利用SSR 標記成功鑒定了小麥－單芒山羊草（Aegilops uniarista Vis.）7N染色體異附加系。武軍等［14］利用SSR技術(shù)對普通小麥與冰草雜交產(chǎn)生的大穗花材料4844的后代株系進行分析，并對大穗多花材料中的冰草P染色體進行了遺傳鑒定。Korzun等［15］以34個小麥品種間染色體代換系為材料，利用45個小麥SSR 標記鑒定大部分代換系是正確的。

小麥-黑麥代換系5R/5A與1R/1D雜交，由于5R、5A、1R和1D有部分同源關(guān)系，小麥ph基因受R組染色體抑制，有可能產(chǎn)生部分同源聯(lián)會，從而發(fā)生染色體易位；5R/5A與1R/1D雜交，F(xiàn)1會產(chǎn)生4個單價體，單價體容易斷裂，斷裂重建，也可以產(chǎn)生易位，因此代換系5R/5A與1R/1D間雜交，可以有計劃的將1R和5R染色體片段導入普通小麥，創(chuàng)制易位系。

本研究選取黑麥5R、1R染色體的特異SSR引物，結(jié)合形態(tài)學觀察，分析小麥-黑麥代換系5R/5A與1R/1D雜交后代中黑麥的遺傳成分，可降低SSR鑒定小麥背景中的外源遺傳物質(zhì)的局限性，今后研究可進一步結(jié)合細胞學、GISH等多種方法分析鑒定小麥-黑麥代換系間雜交后代材料，為小麥遺傳改良和育種篩選良好的基礎(chǔ)材料。

4 結(jié)論

本試驗利用引物 SCM138-5RS，在 1-6、1-7、1-8、1-9、1-10和黑麥中擴增出約188bp黑麥5RS特異片段；引物SCM120-5RL在7個品系和黑麥中均擴增出127bp的5RL特異片段；引物TSM604-1RS在黑麥和7個品系中穩(wěn)定地擴增出一條長約115bp的1RS特異帶，確定7個品系為黑麥的易位系，7個品系均表現(xiàn)大穗、多小穗、抗病、抗旱等優(yōu)點，有利用價值，可作為小麥品種改良的基礎(chǔ)材料。

［1］莊巧生, 王恒立.小麥育種理論與實踐進展［M］.北京：科學普及出版社, 1987.

［2］鐘冠昌, 穆素梅, 張正斌.麥類遠緣雜交［M］.北京：科學出版社, 2002.

［3］李集臨, 王寧, 郭東林, 等.小麥—黑麥染色體代換的研究［J］.植物研究, 2002, 22（2）：220-224.

［4］尚海英, 鄭有良, 魏育明, 吳衛(wèi).黑麥屬基因資源研究進展［J］.麥類作物學報, 2003, 23（1）：86-89．

［5］吳金華, 吉萬全, 李鳳珍.黑麥在小麥改良中的應(yīng)用研究進展［J］.麥類作物學報, 2005, 25（1）：115-119.

［6］曾莉娟, 鄭成木. SSR技術(shù)及其應(yīng)用［J］.熱帶農(nóng)業(yè)科學, 2001（3）：56-59.

［7］崔會肖, 彭永康.小麥近緣種及小麥-簇毛麥染色體代換系、易位系的SSR分析［J］.天津師范大學學報：自然科學版,2005, 25（2）：19-22.

［9］李立會, 李秀全.小麥種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標準［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社, 2006.

［10］Doyle JJ, Doyle JL. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue［J］. Phytochem Bull, 1987, 19：11-15.

［11］任如意, 肖志敏, 李集臨.黑麥通用特異性DNA探針的篩選［J］.麥類作物學, 2007, 27（3）：382-385.

［12］Kofler R, Barto? J, Li G, et al. Development of microsatellite markers specific for the short arm of rye （Secal cereale L.）chromosome 1［J］. Theor Appl Genet, 2008, 117：915-926.

［13］Saal B, Wricke G. Development of simple sequence repeat markers in rye （Secale cereale L.）［J］. Genome, 1999, 42：964-972.

［14］Iqbal N, Reader SM, Caligari PDS, Miller TE. Characterization of Aegilops uniarisatat chromosomes by comparative DNA marker analysis and repetitive DNA sequence in situ hybridization［J］.Theor Appl Genet, 2000, 101（8）：1173-1179.

［15］武軍, 王輝, 劉偉華, 李立會, 楊欣明, 李秀權(quán).小麥新種質(zhì)4844中外源P染色質(zhì)的GISH與SSR分析［J］.西北植物學報 , 2006, 26（6）：1093-1097.

［16］Korzun V, B?rner A, Worland AJ, et al. Application of microsatellite markers to distinguish inter-varietal chromosome substitution lines of wheat（Triticum aestivum L.）［J］.Euphytica, 1997, 95：149-150.