腫瘤轉移抑制基因KISS-1和NM23-H1的原核表達與純化

左芳雷 馮秀娟 陳尚武

腫瘤可以從原發(fā)灶處轉移至遠端器官，這是大部分惡性腫瘤都具有的一大特征，也是導致大多數癌癥患者死亡的重要原因。腫瘤轉移抑制蛋白能夠在腫瘤轉移的多個步驟中發(fā)揮調控作用，在體內阻止或抑制腫瘤轉移過程，是近幾年腫瘤領域的研究熱點。到目前為止，已經明確具有抑制腫瘤轉移功能的基因包括KISS-1基因、KAI1基因、NM23-H1基因等［1，2］。NM23-H1是第一個被發(fā)現，也是被研究得最充分的一個腫瘤轉移抑制基因。它具有的組氨酸激酶活性，核苷二磷酸激酶活性和3'-5'核酸外切酶活性是其發(fā)揮腫瘤轉移抑制功能的重要因素［3，4］。KISS-1是新近發(fā)現的一個腫瘤轉移抑制基因，其編碼的Kisspeptin是一類肽類激素，是G蛋白偶聯(lián)受體GPR45的內源性配體，在抑制腫瘤轉移上扮演重要角色［5-7］。以基因表達和直接施用腫瘤轉移抑制蛋白來治療腫瘤是具有廣闊發(fā)展前景的策略，實際上，國外已經展開了KISS-1 蛋白的臨床前檢測研究［1］。

本研究對人源KISS-1 和NM23-H1 基因進行了克隆和大腸桿菌表達，并得到了純化重組蛋白，旨在為將來的臨床應用積累堅實的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞組織、質粒和菌株 人乳腺癌細胞、胎盤組織由實驗室保藏；pMD19-T simple載體（TaKaRa，大連），大腸桿菌表達載體 pET-30a（+）（Invitrogen，上海）；大腸桿菌E.coli DH5α，BL21（DE3）感受態(tài)細胞（全式金，北京）。

1.1.2 工具酶及其他試劑 限制性內切酶，T4 DNA Ligase，Ex Taq DNA聚合酶，DL2000、DL15000 DNA marker等（TaKaRa，大連）；Trizol 試劑（Invitrogen，上海）；M-MLV反轉錄試劑盒（Promega，北京）；X-Gal、IPTG、抗生素等藥品均為進口或國產生物試劑；引物合成及序列測定由博邁德（Biomed，北京）生物技術有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及反轉錄cDNA制備 取人乳腺癌細胞或胎盤組織放入液氮速凍，用研缽研成粉末，加入1mL Trizol振蕩混勻，室溫放置5min；加入200μL預冷的三氯甲烷，混勻，室溫放置5min；4℃12000r/min離心10min；取上清，加入等體積預冷異丙醇，-20℃沉淀1h；4℃ 12000r/min 離心10min，沉淀以70％預冷乙醇洗滌一次；沉淀自然晾干后以20μL DEPC處理水溶解。

參照試劑盒說明書，合成第一鏈cDNA，步驟為：將 2-5 μL 總 RNA 和 1 μL Oligo（dT）primer 混合，65℃水浴5min；低速離心30s，將液體甩入管底，加入 5 μL 5×buffer和 1 μL反轉錄酶，混勻；42℃水浴1h；95℃處理5min，冰浴冷卻，-20℃保藏備用。1.2.2 KISS-1和NM23-H1的克隆 以胎盤組織cDNA為模板，以引物hKISS-1-F1和hKISS-1-R1擴增KISS1基因，上下游引物分別引入NdeⅠ和XhoⅠ限制性酶切位點，下游引物5'端棄去終止密碼子，使其可以和載體pET-30a（+）C端His-Tag序列相連（表1）；同樣，以乳腺癌細胞cDNA為模板，以引物NM23-H1-F1和NM23-H1-R1擴增NM23-H1基因，上下游引物也分別引入NdeⅠ和XhoⅠ限制性酶切位點，下游引物5'端也棄去終止密碼子（表1）。PCR反應條件為：94℃預變性5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1min，循環(huán) 30次；72℃延伸 10min。將PCR 產物連接到克隆載體pMD19-T simple上，轉化E.coli DH5α，篩選陽性克隆提取質粒pMD19-KISS-1和pMD19-NM23-H1，并進行測序。測序結果和NCBI上發(fā)布的序列進行Blast比對分析。

1.2.3 KISS-1和NM23-H1表達載體的構建和重組菌株構建 以NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切質粒pMD19-KISS-1，pMD19-NM23-H1和 載 體 pET-30a（+）回收目標片段，以T4 DNA Ligase連接過夜。連接產物轉化E.coli DH5α。提取陽性克隆質粒并測序確定目標基因的正確連入，得到表達載體pET30a（+）-KISS-1和 pET30a（+）-NM23-H1。將 pET-30a（+）、pET30a（+）-KISS-1 和 pET30a（+）-NM23-H1分別轉化表達宿主E.coli BL21（DE3），得到KISS-1和NM23-H1的大腸桿菌重組菌株。

表1 基因克隆和載體構建所用到的引物

1.2.4 KISS-1的融合表達載體構建重組菌株構建 以pMD19-KISS-1為模板，以引物hKISS-1-F2和hKISS-1-R2擴增KISS-1，上下游引物分別引入NcoⅠ和XhoⅠ限制性酶切位點（表1），PCR產物的TA克隆過程同1.2.2，得到pMD19-KISS-1-fusion。pMD19-KISS-1-fusion以 NcoⅠ和XhoⅠ雙酶切連入pET-30a（+）得到融合表達載體 pET30a（+）-KISS-1-fusion，KISS-1N端和載體上的一段已有氨基酸序列相連并含有His-Tag標簽。另外，以pMD19-NM23-H1為模板，以引物NM23-H1-F1和NM23-H1-R2擴增NM23-H1，上下游引物分別引入NdeⅠ和KpnⅠ限制性酶切位點（表1），PCR產物的TA克隆過程同1.2.2，得到pMD19-NM23-H1-fusion。將pMD19-NM23-H1-fusion以 NdeⅠ和KpnⅠ雙酶切連入到以相同酶切位點酶切的pET30a（+）-KISS-1-fusion中，替換了載體上已有的氨基酸序列和His-Tag標簽，將KISS-1融合在NM23-H1C端，得到融合表達載體pET30a（+）-NK-fusion。pET30a（+）-KISS-1-fusion和pET30a（+）-NK-fusion的重組菌株構建方法同

1.2.3。

1.2.5 KISS-1和NM23-H1誘導表達 pET-30a（+）、pET30a（+）-KISS-1和 pET30a（+）-NM23-H1的重組菌株單菌落過夜培養(yǎng)，按0.5％接種于10mL新鮮的LB 培養(yǎng)基中，37℃ 250r/min培養(yǎng)3h 至OD600為0.4-0.6左右，將菌液等分為兩份，一份加入終濃度為0.5mmol/L的IPTG，另一份做對照，于28℃ 250r/min誘導表達3h。離心收集菌體，以預冷的PBS緩沖液洗滌兩次，溶解于1mL PBS，以320W功率超聲波破碎細胞，超聲開3s，停5s。采用15％的SDS-PAGE凝膠電泳分析蛋白表達情況。

1.2.6 重組蛋白的純化 利用pET-30a（+）載體上的His-Tag，采用親和層析方法純化KISS-1和NM23-H1重組蛋白。KISS-1和NM23-H1重組菌株過夜培養(yǎng)，按0.5％接種于400mL新鮮的LB 培養(yǎng)基中，37℃ 250r/min培養(yǎng)3h 至OD600為0.4-0.6左右，加入終濃度為0.5mmol/L的IPTG，于28℃ 250r/min誘導表達過夜（約8-10h）。4℃ 6000r/min離心收集菌體，以預冷的PBS緩沖液洗滌兩次，溶解于10mL PBS，加入1mmol/L的蛋白酶抑制劑PMSF和0.5mg/mL的溶菌酶，冰浴30min。以320 W率超聲波破碎細胞，超聲開3s，停5s?？扇苄缘鞍准兓苯訉⒊暡ㄆ扑樯锨逡哼M樣到含有Ni-NTA填料的親和層析柱中，收集以不同濃度咪唑梯度洗脫的蛋白。采用15％的SDS-PAGE凝膠電泳分析回收蛋白。

2 結果

2.1 RNA提取及反轉錄

采用Trizol抽提人乳腺癌細胞和胎盤組織總RNA，結果（圖1）顯示，RNA提取效果較好，可以進一步做反轉錄。以Oligo（dT）primer為引物做反轉錄，得到cDNA文庫，如圖2所示，cDNA呈均勻的彌散狀態(tài)，可以用作PCR克隆的模板。

2.2 KISS1和NM23-H1的克隆

以人乳腺癌細胞和胎盤組織cDNA為模板，設計引物（表1）擴增NM23-H1和KISS-1基因。結果（圖3）顯示，以乳腺癌細胞cDNA為模板擴增得到了目標大小的NM23-H1基因（467bp），以胎盤組織cDNA為模板擴增得到了目標大小的KISS-1基因（423bp）。

圖1 人乳腺癌細胞和胎盤組織總RNA

圖2 人乳腺癌細胞和胎盤組織cDNA

圖3 NM23-H1（A）和KISS-1（B）的PCR產物電泳

PCR產物經切膠回收，連接T載體pMD19-T simple，陽性克隆進行測序分析。測序結果和NCBI上發(fā)布的序列進行Blast比對分析，結果顯示與GenBank上公布的KISS-1和NM23-H1基因序列同源性達100％，可以進一步做表達研究。

2.3 表達載體的構建與轉化

將KISS-1和NM23-H1分別連接到大腸桿菌表達載體pET-30a（+）上，N端融合His-Tag標簽，以便于純化重組蛋白。在分析了重組KISS-1和NM23-H1的表達情況后，又構建了KISS-1和NM23-H1的融合表達載體，即將KISS-1N端和載體上的已有氨基酸序列相連并含有His-Tag標簽，另外將NM23-H1替換載體序列連接在KISS-1N端，這樣可以增加KISS-1的表達效率。載體的具體構建結構，見圖4。明顯的表達條帶。

圖4 KISS-1和NM23-H1的表達載體構建結構圖

圖5 KISS-1和NM23-H1表達的SDS-PAGE分析

2.4 重組蛋白誘導表達

pET30a（+）-KISS-1和 pET30a（+）-NM23-H1重組菌株經IPTG誘導，SDS-PAGE電泳（圖5）分析顯示，NM23-H1得到很好的表達，在20kD處有一條高豐度表達蛋白（箭頭所示），表達量占總表達量的50％以上，表觀分子量略高于理論值（理論值18.2kD）。而KISS-1沒有明顯差異蛋白條帶。

分析 pET30a（+）-KISS-1-fusion 和 pET30a（+）-NK-fusion重組菌株融合表達KISS-1蛋白情況，結果表明在細胞破碎上清中，KISS-1-fusion有極少量的可溶性表達蛋白，而NK-fusion幾乎沒有可溶性表達（數據未附）。包涵體SDS-PAGE電泳結果（圖6）表明，KISS-1-fusion 即 KISS-1和載體融合的基因得到了大量表達，但是大部分為沒有活性的不可溶包涵體蛋白，占總包涵體量的70％以上，其表觀分子量為24kD左右，比理論值高5kD（理論值19.6kD）。然而，KISS-1與NM23-H1融合基因沒有得到

圖6 KISS-1-fusion 和 NK-fusion表達的SDS-PAGE分析

2.5 重組蛋白的純化

對pET30a（+）-KISS-1-fusion重組菌株表達的KISS-1-fusion包涵體蛋白和pET30a（+）-NM23-H1重組菌株表達的NM23-H1蛋白進行親和層析純化，以SDS-PAGE電泳分析純化效果，結果如圖7所示。由圖7-A可見，在含有6mol/L脲和300mmol/L咪唑溶液洗脫下，KISS-1-fusion蛋白被洗脫下來，在目標蛋白上方有兩條蛋白帶，分子量為50kD左右的蛋白帶是非特異性蛋白殘留，而分子量為35kD大小的蛋白帶，推測為KISS-1-fusion發(fā)生聚合而得。由圖7-B可見，NM23-H1在含300mmol/L咪唑溶液洗脫下得到分離，但是具有兩條蛋白帶，分子量分別為18kD和15kD左右，推測15kD蛋白帶是由18kD蛋白帶發(fā)生部分降解所致。進一步研究需要通過質譜鑒定來確定純化后蛋白產生的不同結構。

圖7 KISS-1-fusion包涵體重組蛋白（A）和NM23-H1重組蛋白（B）的純化

3 討論

研究表明，腫瘤細胞在癌癥發(fā)展的早期其實就已經開始從原發(fā)灶脫離并轉移到別處了，腫瘤轉移抑制基因編碼的蛋白能夠在體內阻止或抑制腫瘤轉移過程。目前已經發(fā)現了20多種腫瘤抑制基因，其中包括能調控腫瘤細胞代謝信號通路的基因以及能夠調控腫瘤細胞黏附、遷移、死亡以及血管生成過程的基因［1］。KISS-1是目前研究較多的腫瘤轉移抑制基因，其編碼蛋白具有抑制腫瘤轉移，調節(jié)生殖功能以及影響內分泌等作用［7］；NM223-H1是研究較為清晰的腫瘤轉移抑制基因，其編碼蛋白具有影響信號傳導系統(tǒng)的運作，參與微管聚合運動，影響細胞黏合和細胞有絲分裂等［8］。

國內學者早期做過NM223-H1的原核表達［8，9］，得到含有生物活性的KISS-1蛋白，然而，國內研究者還沒有關于KISS-1的表達研究。本研究在構建KISS-1重組菌株時發(fā)現，沒有融合其他序列的KISS-1轉化宿主菌后會導致宿主死亡，幾乎得不到陽性克隆，轉化毒性蛋白表達宿主BL21（DE3）plysS 也得不到陽性克隆，推測KISS-1的本底表達可能對宿主的正常生長和代謝造成影響。將KISS-1與載體序列連接后，KISS-1得到了成功表達，雖然大部分表達產物為包涵體形式。進一步的研究需要鑒定分析純化蛋白的結構組成，并對其生物學活性進行分析，評價其作為生物藥物分子的性能。

另外，利用乳酸菌呈遞預防和治療藥物分子實施疾病治療是近幾年研究的熱點［10-12］，有些研究已經進入臨床試驗階段［13］。本研究所在實驗室也對KISS-1進行了以乳酸菌為宿主的分泌型表達，通過NICE系統(tǒng)實現了經過依據乳酸菌密碼子偏好性修飾的KISS-1的表達（未發(fā)表數據）。這些基礎研究為將來重組腫瘤轉移抑制基因蛋白和重組菌株投入到臨床應用打下堅實基礎。

4 結論

本研究從人胎盤組織和乳腺癌細胞中克隆得到腫瘤轉移抑制基因KISS-1和NM23-H1，并導入到大腸桿菌BL21（DE3）中表達。研究證明，NM23-H1能夠在大腸桿菌中可溶性表達；而KISS-1需要與載體的部分序列融合才能夠得到有效表達，且表達產物為不可溶的包涵體蛋白。

［1］Smith SC, Theodorescu D. Learning therapeutic lessons from metastasis suppressor proteins ［J］. Nature Reviews, 2009, 9：253-264.

［2］Yoshida BA,Dubauskas Z,Sokoloff MM, et al. Metastasissuppressor genes：a review and perspective on an emerging field ［J］.Journal of the National Cancer Institute, 2000, 92（21）：1717-1730.

［3］葉蘇娟, 朱文.nm23-H1調控腫瘤侵襲轉移分子機制研究進展［J］. 生命科學 , 2009, 21（1）：107-111.

［4］Zhang QB, McCorkle JR, Novak M. Metastasis suppressor function of NM23-H1requires its 3'-5' exonuclease activity ［J］. International Journal of Cancer, 2011, 128（1）：40-50.

［5］Kotani M, Detheux M, Vandenbogaerde A. The metastasis suppressor gene KiSS-1encodes kisspeptins, the natural ligands of the orphan G protein-coupled receptor GPR54［J］. The Journal of Biological Chemistry, 2001, 276（37）：34631-34636.

［6］Ohtaki T, Shintani Y, Honda S. Metastasis suppressor gene KiSS-1encodes peptide ligand of a G-protein-coupled receptor ［J］. Nature,2001, 411：613-617.

［7］Popa SM, Clifton DK, Steiner RA. The role of kisspeptins and GPR54in the neuroendocrine regulation of reproduction ［J］. Annual Review of Physiology, 2008, 70：213-238.

［8］侯宇, 趙麗淦, 張美英, 等. Nm23-H1/ NDPK-A 基因在大腸桿菌中的高效表達及產物純化的研究［J］.中國生物化學與分子生物學, 1998, 14（6）：655-660.

［9］孫艷梅, 趙利淦, 張美英, 等.重組人融合基因Nm23-H1/HbFGF的構建及其在大腸桿菌中表達的研究［J］. 生物工程學報 , 2000, 16（5）：551-556.

［10］Wells JM, Mercenier A. Mucosal delivery of therapeutic and prophylactic molecules using lactic acid bacteria ［J］. Nature Reviews, 2008, 6：349-362.

［11］Steidler L, Hans W, Schotte L, et al. Treatment of murine colitis by Lactococcus lactis secreting interleukin-10［J］. Sciene, 2000, 289（5483）：1352-1355.

［12］Yao J, Wang JY, Lai MG, et al. Treatment of mice with dextran sulfate sodium-induced colitis with human interleukin 10secreted by transformed Bifidobacterium longum ［J］. Molecular Pharmaceutics, 2011, 8（2）：488-497.

［13］Braat H, Rottiers P, Homomes DW, et al. A phase I trial with rransgenic bacteria expressing interleukin-10 in crohns disease ［J］.Clinical Gastroenterology and Hepatology, 2006, 4（6）：754-759.