大鼠脊髓源性少突膠質(zhì)前體細胞的生物學特性＊

吳 斌， 吳永超， 潘海濤， 郭曉東， 鄭啟新

華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬協(xié)和醫(yī)院骨科，武漢 430022

軸突脫髓鞘在脊髓損傷、多發(fā)性硬化和脊髓側(cè)索硬化等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理改變中都占有重要地位，脫髓鞘的軸突失去了正常的神經(jīng)傳導功能，導致機體出現(xiàn)感覺運動功能障礙，因此促進髓鞘再生是多種脊髓疾病的治療目標。軸突脫髓鞘是因各種損傷因素導致少突膠質(zhì)細胞的凋亡、壞死引起的，當軸突脫髓鞘后，脫髓鞘病變周圍的少突膠質(zhì)前體細胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs）增殖并遷移至脫髓鞘區(qū)域，分化為少突膠質(zhì)細胞包裹軸突形成新的髓鞘，這一過程稱為髓鞘再生。有研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同區(qū)域的OPCs具有不同的生物學特性［1］，而且OPCs并不能遠距離地遷移，脊髓的脫髓鞘病變，只能由位于脊髓的OPCs完成髓鞘再生［2］。因此建立脊髓源性OPCs體外培養(yǎng)模型，并闡明其生物學特性對研究脊髓脫髓鞘疾病的發(fā)病機制及促進髓鞘再生具有重要意義。本研究采用免疫吸附法原代培養(yǎng)大鼠脊髓源性OPCs，并在體外觀察其增殖及分化等生物學特性，以期為使用各種干預手段促進OPCs更好地完成髓鞘再生奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

出生1～3d的Sprague－Dawley大鼠（同濟醫(yī)學院實驗動物學部提供），雌雄不限，谷氨酰胺（Gib－co公司），DMEM／F12 培養(yǎng)液及胎牛血清（Hyclone公司），N2 添加劑及B27 添加劑（Invitrogen公司），血小板源性生長因子（platelet－derived growth factor，PDGF－aa）及堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）（晶美公司），Hoechst33342（Hyclone公司），胰酶及多聚賴氨酸（Sigma 公司），髓鞘堿性蛋白（myelin basic protein，MBP）抗體及半乳糖腦苷脂（actocerebroside，GalC）抗體（Abcam 公司），RAN－2 抗體、NG2抗體及A2B5 抗體（Invitrogen 公司），熒光標記二抗（武漢博士德公司）。

1.2 大鼠脊髓源性OPCs的分離培養(yǎng)

將新生大鼠斷頸處死后，75%乙醇浸泡消毒3 min，取出延髓以下脊髓組織，剝除腦脊膜及血管，將取出的脊髓切為1mm3的組織塊，浸入D－Hank液中，加入0.1%的胰蛋白酶，充分吹打混勻后置于37℃恒溫水浴中消化30min，之后加入等體積的含20%胎牛血清的DMEM／F12培養(yǎng)液終止消化。將細胞懸液用70μm 的篩網(wǎng)過濾、離心及重懸后，接種至包被了RAN－2抗體的培養(yǎng)皿中以去除星形膠質(zhì)細胞及腦脊膜細胞，30 min 后收集未貼壁的細胞，接種至包被了A2B5抗體的培養(yǎng)皿中以獲得純化的OPCs，1h 后用0.25%的胰酶消化貼壁的細胞，漂洗、離心、重懸后接種至放有包被了多聚賴氨酸玻片的6孔板中，用無血清培養(yǎng)液（DMEM／F12含1%N2，1%B27，20 ng／mL bFGF，10 ng／mL PDGF－aa）進行培養(yǎng)，每2天更換1／3培養(yǎng)液。

1.3 大鼠脊髓源性OPCs的鑒定

免疫吸附純化的OPCs經(jīng)過24h的培養(yǎng)后，進行免疫熒光染色觀察其特異性標志物A2B5 及NG2的表達情況，并計算其陽性率。具體方法如下：4%多聚甲醛固定細胞玻片，PBS 沖洗后，加入10%羊血清37℃孵育30min，加入A2B5（1∶200）及NG2（1∶200）抗體，4℃過夜；PBS漂洗后分別加入相應的熒光標記的二抗（1∶500），37℃孵育30 min，PBS漂洗后加入Hoechst33342（1∶500）37℃避光孵育5min，甘油封片?？瞻讓φ沼肞BS代替一抗。隨機取5個視野，計算每個視野中NG2陽性細胞所占Hoechst33342染色細胞的百分比。

1.4 大鼠脊髓源性OPCs增殖能力的檢測

采用Alarm blue法檢測OPCs的增殖能力，繪制生長曲線。選擇生長良好的第2代的OPCs制成細胞懸液，將細胞密度調(diào)整為1×104／mL，以每孔200μL細胞懸液接種于96孔板，分7組，每組5個復孔。連續(xù)培養(yǎng)7d，每天取1組細胞，每孔加入20 μL Alarm blue原液，在細胞培養(yǎng)箱中孵育2h后用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測各孔A 值（吸收波長570nm）。

1.5 大鼠脊髓源性OPCs的誘導分化

將培養(yǎng)3d，生長良好的OPCs進行誘導分化培養(yǎng)。撤去原來的普通培養(yǎng)液，加入誘導培養(yǎng)液（主要成分為DMEM／F12，1%NS，1%B27，30 ng／mL T3），在5%CO2，飽和濕度，37℃條件下培養(yǎng)，每3天更換新鮮誘導培養(yǎng)液，誘導培養(yǎng)6d后行MBP及GalC免疫熒光染色，具體步驟同1.3項。

2 結(jié)果

2.1 原代培養(yǎng)的大鼠脊髓源性OPCs的生長情況

本研究采用免疫吸附法對大鼠脊髓組織中的OPCs進行純化，新生大鼠脊髓組織經(jīng)消化、過濾后獲得了混雜細胞懸液，鏡下觀察懸液中的大部分細胞呈球形、懸浮狀，將該細胞懸液依次經(jīng)過包被RAN－2抗體和A2B5抗體的培養(yǎng)皿分離純化，所得細胞胞體呈圓形，周圍折光明顯，部分細胞有雙極突起，接種24h后，可見大部分細胞貼壁，呈圓形或橢圓形，有雙極突起的細胞增多。

2.2 大鼠脊髓源性OPCs的鑒定

將原代培養(yǎng)24h的細胞經(jīng)固定后進行免疫熒光染色，觀察OPCs的特異性標志物A2B5及NG2的表達情況，結(jié)果顯示：大部分細胞呈A2B5 及NG2陽性（圖1），鏡下隨機選取5 個視野，計算A2B5及NG2陽性細胞比例，發(fā)現(xiàn)兩者陽性的細胞比例均達95%以上。

圖1 激光共聚焦顯微鏡下觀察大鼠脊髓源性OPCs的免疫熒光染色（×200）Fig.1 The immunofluorescence staining of OPCs derived from the spinal cord of rats under the confocal laser scanning microscopy（×200）

2.3 大鼠脊髓源性OPCs在體外的增殖能力

本研究采用Alarm blue法檢測OPCs的體外增殖能力，結(jié)果如圖2 所示。OPCs在體外環(huán)境的倍增時間約為4d，這說明本研究培養(yǎng)的大鼠脊髓源性OPCs在體外具有良好的增殖能力。

圖2 大鼠脊髓源性OPCs的細胞生長曲線Fig.2 The growth curve of OPCs derived from the spinal cord of rats

2.4 大鼠脊髓源性OPCs向成熟少突膠質(zhì)細胞的定向分化

加入誘導培養(yǎng)液24h后，部分OPCs開始出現(xiàn)肉眼可見的形態(tài)學變化，表現(xiàn)為胞體略增大，突起增多，隨著誘導時間的延長，發(fā)生形態(tài)變化的細胞逐漸增多，至誘導6d后大量細胞表現(xiàn)為成熟少突膠質(zhì)細胞樣形態(tài)，免疫熒光染色顯示，這些細胞呈MBP及GalC陽性（圖3），說明這些細胞為成熟的少突膠質(zhì)細胞。

圖3 激光共聚焦顯微鏡下觀察大鼠脊髓源性OPCs的分化潛能（×200）Fig.3 The multiple differentiation potential of OPCs derived from the spinal cord of rats under the confocal laser scanning microscopy（×200）

3 討論

少突膠質(zhì)前體細胞來自于胚胎發(fā)育早期神經(jīng)管腹側(cè)神經(jīng)上皮細胞，隨著神經(jīng)管的發(fā)育，OPCs逐步增殖、遷移并分化為成熟少突膠質(zhì)細胞，形成中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突的髓鞘［3］。OPCs作為一種成體干細胞廣泛分布于成年動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)，當缺血、缺氧、創(chuàng)傷、感染及自身免疫反應等各種損傷因素使少突膠質(zhì)細胞凋亡、壞死從而導致脫髓鞘病變時，OPCs開始增殖并遷移至脫髓鞘區(qū)域，分化為少突膠質(zhì)細胞包裹脫髓鞘軸突形成新的髓鞘。目前認為，OPCs并非一種均質(zhì)、單一的細胞類型，而且源自中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同區(qū)域的OPCs具有不同的生物學特性，例如來自海馬的OPCs表達成熟星形膠質(zhì)細胞標志物S100，而來自大腦皮層的OPCs 并不表達S100［4］。還有研究表明發(fā)生脫髓鞘病變后，只能招募脫髓鞘病變周圍2mm 范圍內(nèi)的OPCs進行髓鞘再生［5］，因此脊髓的脫髓鞘病變，只能由位于脊髓的OPCs完成髓鞘再生。綜上所述，建立OPCs體外培養(yǎng)模型，并闡明其生物學特性對促進脊髓脫髓鞘疾病的髓鞘再生具有重要意義。

原代培養(yǎng)OPCs首先需要對OPCs進行分離純化，目前常用的分離純化方法有兩類：一類是利用不同細胞粘附性的差異純化OPCs，如差速振蕩法［6］；另一類是利用不同細胞表面標志物的差異，通過免疫吸附純化OPCs，包括免疫磁珠法［7］、流式細胞儀分選法［8］以及培養(yǎng)皿免疫吸附法［9］。差速振蕩法操作簡便，但獲得的OPCs純度較低；免疫磁珠法和流式細胞儀分選法所獲得的OPCs純度較高，但其成本較高，而且操作復雜，應用不是很廣泛；培養(yǎng)皿免疫吸附法操作相對簡單，而且可以獲得較高純度的OPCs，因此本研究采用培養(yǎng)皿免疫吸附法從新生大鼠脊髓組織中分離純化OPCs。脊髓組織中存在多種類型的細胞，其中對OPCs原代培養(yǎng)影響最大的是星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞和腦脊膜細胞。RAN－2是星形膠質(zhì)細胞、室管膜細胞和腦脊膜細胞的特異性表面標志物，因此本研究首先利用包被了RAN－2抗體的培養(yǎng)皿去除星形膠質(zhì)細胞及腦脊膜細胞，還有些研究者主張再用成熟少突膠質(zhì)細胞特異性標志物GalC 包被的培養(yǎng)皿去除少突膠質(zhì)細胞［10］，然而我們在預實驗中發(fā)現(xiàn)這一步驟會使OPCs大量損失，因此本研究沒有采用這一步驟，而是直接用包被了A2B5 抗體的培養(yǎng)皿富集純化OPCs。后續(xù)的免疫熒光染色鑒定結(jié)果顯示本研究獲得的OPCs純度在95%以上，這表明本研究采用的免疫吸附法是純化OPCs簡便、高效的方法。

在體外條件下維持OPCs的增殖能力，需要采用無血清培養(yǎng)液并添加生長因子，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)bFGF、PDGF－aa、IGF、NGF 等生長因子能夠促進OPCs增殖。本研究在培養(yǎng)液中添加了bFGF 和PDGF－aa，同時使用了B27和N2營養(yǎng)成分，結(jié)果顯示該培養(yǎng)液能夠使OPCs保持未分化狀態(tài)，并且增殖良好。本研究采用Alarm blue法檢測了原代培養(yǎng)的脊髓源性OPCs的增殖能力，實驗結(jié)果顯示脊髓源性OPCs在體外培養(yǎng)條件下能夠繼續(xù)增殖，其倍增時間約為4d。OPCs作為一種成體干細胞，具有多向分化潛能，在特定條件下可分化為少突膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元。本研究對脊髓源性OPCs進行了誘導分化實驗，結(jié)果顯示經(jīng)誘導培養(yǎng)24h后，部分OPCs就開始出現(xiàn)肉眼可見的形態(tài)學變化，隨著誘導時間的延長，發(fā)生形態(tài)變化的細胞逐漸增多，誘導6d后大部分細胞呈MBP 及GalC 陽性，這說明脊髓源性OPCs在體外培養(yǎng)條件下仍然具備良好的分化為少突膠質(zhì)細胞的潛能。

綜上所述，本研究采用免疫吸附法成功建立了大鼠脊髓源性OPCs的體外培養(yǎng)模型，并通過體外實驗觀察其增殖及分化等生物學特性，實驗結(jié)果表明本研究培養(yǎng)的脊髓源性OPCs在體外條件下具有良好的增殖能力及分化為成熟少突膠質(zhì)細胞的能力，為進一步研究脊髓源性OPCs如何參與脊髓脫髓鞘疾病的病理過程奠定了基礎。

［1］ Power J，Mayer－Preschel M，Smith J，et al.Oligodendrocyte precursor cells from different brain regions express divergent properties consistent with the differing time courses of myelination in these regions［J］.Dev Biol，2002，245（2）：362－375.

［2］ Mctigue D M，Wei P，Stokes B T.Proliferation of NG2－positive cells and altered oligodendrocyte numbers in the contused rat spinal cord［J］.J Neurosci，2001，21（10）：3392－3400.

［3］ Trotter J，Karram K，Nishiyama A.NG2cells：Properties，progeny and origin［J］.Brain Res Rev，2010，63（1／2）：72－82.

［4］ Karram K，Goebbels S，Schwab M，et al.NG2－expressing cells in the nervous system revealed by the NG2－EYFP－knockin mouse［J］.Genesis，2008，46（12）：743－757.

［5］ Franklin R J，Gilson J M，Blakemore W F.Local recruitment of remyelinating cells in the repair of demyelination in the central nervous system［J］.J Neurosci Res，1997，50（2）：337－344.

［6］ Sypecka J，Sarnowska A，Domanska－Janik K.Crucial role of the local micro－environment in fate decision of neonatal rat NG2progenitors［J］.Cell Prolif，2009，42（5）：661－671.

［7］ Cizkova D，Cizek M，Nagyova M，et al.Enrichment of rat oligodendrocyte progenitor cells by magnetic cell sorting［J］.J Neurosci Methods，2009，184（1）：88－94.

［8］ Assanah M，Lochhead R，Ogden A，et al.Glial progenitors in adult white matter are driven to form malignant gliomas by platelet－derived growth factor－expressing retroviruses［J］.J Neurosci，2006，26（25）：6781－6790.

［9］ Cao Q，He Q，Wang Y，et，al Transplantation of ciliary neurotrophic factor－expressing adult oligodendrocyte precursor cells promotes remyelination and functional recovery after spinal cord injury［J］.J Neurosci，2010，30（8）：2989－3001.

［10］ Barres B，Schmid R，Sendtner M，et，al.Multiple extracellular signals are required for long－term oligodendrocyte survival［J］.Development，1993，118（1）：283－295.