增強CpG免疫刺激作用途徑的研究進(jìn)展

徐娜，張雪梅，王欽富

CpG 基序（CpG motifs）是指含有非甲基化的胞嘧啶（C）和鳥嘌呤（G）核苷酸核心的寡聚脫氧核苷酸（ODN）序列，又稱為免疫刺激序列，一般為6個寡聚核苷酸。1995年，Krieg等[1]研究發(fā)現(xiàn)非甲基化的CpG 二寡聚核苷酸是病原體 DNA 免疫刺激活性的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，自此，對 CpG 基序的各種研究得以展開，包括 CpG 基序免疫刺激機制、CpG 基序個數(shù)及結(jié)構(gòu)對免疫刺激活性影響、CpG 寡聚脫氧核苷酸作為佐劑使用等。含有非甲基化 CpG 二核苷酸的寡聚脫氧核苷酸作為一種免疫增強劑，在體內(nèi)和體外均表現(xiàn)免疫刺激作用，可以引起先天性免疫反應(yīng)。CpG 在體內(nèi)能引起明顯且多樣化的免疫作用，包括樹突狀細(xì)胞和NK 細(xì)胞增殖、巨噬細(xì)胞和B 細(xì)胞的促炎癥細(xì)胞因子表達(dá)、Th1/Th2免疫應(yīng)答的調(diào)控、血循環(huán)系統(tǒng)中的補體作用[2]。CpG 寡聚脫氧核苷酸序列作為佐劑時可明顯延長機體免疫記憶的時間，在較低濃度抗原刺激時 B 細(xì)胞就能反應(yīng)，產(chǎn)生更高純度的抗體[3-4]。

作為疫苗佐劑，CpG 寡聚脫氧核苷酸在機體內(nèi)的傳遞速率和降解速度是影響其效力的關(guān)鍵問題。而體型較大的動物需要較高的CpG 寡聚脫氧核苷酸注射量才能引起有效反應(yīng)，一般要求 10 mg 以上，致使 CpG 在動物疫苗實際應(yīng)用中成本較高。因此，研究增強 CpG 佐劑作用，減少CpG 應(yīng)用劑量，會增加 CpG 寡聚脫氧核苷酸的應(yīng)用與普及，在疾病防治中具有重要的實際意義。本文就近年有關(guān)提高 CpG 免疫刺激作用的新途徑進(jìn)行綜述。

1 與傳統(tǒng)佐劑苦杏仁酶、鋁佐劑組合

誘導(dǎo) Th1 型免疫反應(yīng)的CpG 與誘導(dǎo) Th2 型免疫反應(yīng)的其他種類佐劑（如皂苷 A 或苦杏仁酶）的組合能導(dǎo)致Th1/Th2 免疫反應(yīng)的相對平衡，這種作用在諸如鼠、兔、豬、牛等動物試驗中得到證明。CpG 與苦杏仁酶聯(lián)合制劑能明顯增加血清中和抗體。事實上，即使很少量的CpG（250 μg）與苦杏仁酶混合引起的作用也比單獨使用較大量 CpG（25 mg）強很多[5]。在綿羊體內(nèi) CpG是 2′5′A 合成酶的誘導(dǎo)劑。新生羊肺注入 CpG 與苦杏仁酶制劑，可引起 2′5′A合成酶分泌量達(dá)到最高，IFN-α、IFN-γ 分泌也有所增加，而且 CpG 用量減少 80%[6]，在豬體內(nèi)的試驗表明 10% 苦杏仁酶和CpG 混合物引起的免疫反應(yīng)與30% 苦杏仁酶和CpG 混合物引起的免疫反應(yīng)效果相同[7]，在小鼠、羊的動物實驗中，兩種物質(zhì)混合后IgG1/IgG2a 降低，IFN-γ分泌增加，小鼠脾臟 IL-4 分泌減少[6]，顯示出兩者聯(lián)合時對Th1/Th2 免疫反應(yīng)平衡的影響，展現(xiàn)兩者聯(lián)合使用在疫苗中的潛力?？嘈尤拭冈鰪?CpG 免疫刺激作用的具體機制還不明確，可能是因為苦杏仁酶引起注射位點組織損傷、發(fā)炎、細(xì)胞死亡、免疫細(xì)胞被募集，進(jìn)而被 CpG 激活，而且苦杏仁酶作為乳劑可以幫助 CpG 緩慢釋放，增加反應(yīng)持久性。

鋁具有免疫增強作用，是一種Th2 型佐劑，而 CpG是一種強大的Th1型佐劑，鋁和CpG 聯(lián)用時，有助于平衡Th1/Th2 型免疫應(yīng)答。研究認(rèn)為鋁佐劑增強 CpG 免疫刺激作用的原因可能是鋁激活一種NOD 樣受體 Nlrp3， Nlrp3可與TLR4 協(xié)同作用對抗細(xì)菌脂多糖[8]。

2 與聚磷腈組合

聚磷腈主鏈磷原子上的兩個側(cè)基可被具有不同特性的有機基團取代，從而得到性能不同的高分子聚合物，取代基的性質(zhì)和數(shù)目會影響聚磷腈高分子的物化性質(zhì)。PCPP是聚磷腈的一種，它是一類人工合成的可溶于水、可生物降解的聚合高分子物質(zhì)，具有特殊結(jié)構(gòu)和其他有機高分子難以比擬的特性，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域被用于疫苗佐劑和藥物載體（表1）。PCPP 與CpG 聯(lián)合使用有兩種途徑：一是可溶性的PCPP-CpG 制劑；另一種是用單價鹽溶液（NaCl）和二價陽離子（CaCl2）處理 PCPP，通過凝聚形成直徑為0.5～2.5 μm 含 CpG的PCPP 球狀微粒。

表1 聚磷腈的應(yīng)用

PCPP 免疫時，Th2 反應(yīng)占優(yōu)勢；可溶性的PCPP-CpG誘導(dǎo)特異性抗體 IgG1 表達(dá)，IgG2a 反應(yīng)顯著增強，抗體水平是單獨使用 CpG 或者 PCPP 所無法達(dá)到的，產(chǎn)生的IFN-γ 明顯增加[9]；當(dāng)含 CpG的PCPP 球狀微粒免疫小鼠時，引發(fā)強烈的Th1 反應(yīng)，而且 CpG 在淋巴細(xì)胞中停留的時間更長，但是受球狀微粒直徑大小的影響，微粒崩解時間 10～24 h 不等。

對 PCPP 佐劑作用機理的研究較少，機制尚不明確，對于PCPP 與CpG 協(xié)同作用的機制也不清楚。PCPP 作為一種高分子物質(zhì)，在室溫避光條件下能保存數(shù)年，臨床應(yīng)用之前還需要更多的實驗依據(jù)以保證使用的安全性。

3 與多種TLR組合聯(lián)用

病原體相關(guān)分子模式（PAMP）包括脂類、蛋白和核酸。不同種類 TLR 可以識別不同種類 PAMP，引起的下游反應(yīng)也各不相同[10]。CpG 基序作為一種PAMP 可與哺乳動物的TLR9 相互識別，進(jìn)而啟動依賴 MyD88的信號級聯(lián)反應(yīng)[11]，提高 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平，引發(fā)多種細(xì)胞的成熟、分化、增殖，多種細(xì)胞因子的表達(dá)增加。

聚肌胞苷酸 poly(I:C) 作為TLR3 配體，可被 TLR3識別，激活 MyD88 依賴和非依賴途徑[12]。Poly(I:C) 已在很多獸用疫苗中作為佐劑使用，它可以有效增強 Th1 型反應(yīng)，在豬體內(nèi)它能有效地誘導(dǎo) IFN的產(chǎn)生，而且誘導(dǎo)單核細(xì)胞 MHCII和CD80/CD86的基因表達(dá)以及趨化因子、TLR-5、TLR-9、IL-12p35的產(chǎn)生[13]。Poly(I:C) 與CpG 聯(lián)合使用時，能協(xié)同上調(diào)細(xì)胞因子的表達(dá)，包括 IL6、IL1A、IFNA6、IFNB1、IL33、IL6、IL19、IL12A、IL10、CSF3、IL1F6等。有趣的是，編碼 IL33、IL19、IL12A和神經(jīng)肽的基因在poly(I:C) 與CpG 兩種物質(zhì)分別刺激時不會發(fā)生明顯變化，但是當(dāng) poly(I:C) 與CpG 兩種物質(zhì)聯(lián)合使用時表達(dá)量會強烈增加。

R-848是人類 TLR7/8的人造配體。在HBsAg 疫苗動物試驗中，R-848和CpG 均有免疫刺激作用，CpG 激活體液免疫和細(xì)胞免疫的作用要優(yōu)于R-848。然而，CpG 寡聚脫氧核苷酸和R-848 聯(lián)合應(yīng)用并沒有表現(xiàn)協(xié)同免疫刺激作用，原因可能是兩者作為不同 TLR的配體，在激活下游反應(yīng)時 CpG 寡聚脫氧核苷酸和R-848 重疊激活免疫細(xì)胞[14]。

4 佐劑共傳遞系統(tǒng)

CpG 寡核苷酸的臨床應(yīng)用面臨很多問題，包括在機體內(nèi)的穩(wěn)定性、毒性，不利的藥代動力學(xué)特點，缺少靶細(xì)胞特異性等。因此，有必要構(gòu)建有效保護 CpG 寡聚脫氧核苷酸并有助于抗原與CpG 寡聚脫氧核苷酸共傳遞的復(fù)合載體系統(tǒng)。

基于脂質(zhì)體的傳遞系統(tǒng)可用于保護 CpG 寡核苷酸，調(diào)節(jié) CpG 寡核苷酸分配，從而提高免疫細(xì)胞定位效率，促進(jìn)胞內(nèi)攝取。脂質(zhì)體介導(dǎo)的傳遞能增加 CpG 寡核苷酸的免疫刺激效應(yīng)，提高預(yù)防和治療效率。脂質(zhì)體封裝 CpG寡核苷酸為其達(dá)到最佳免疫刺激和治療效果提供了可行的方法。含CpG 寡聚脫氧核苷酸的脂質(zhì)體微粒作為佐劑與單純 CpG寡聚脫氧核苷酸佐劑相比，CpG 被遞呈細(xì)胞攝取的幾率提高近一倍，體液免疫（抗原特異性血清、IgG2a、IgA、CTL分泌量）和細(xì)胞免疫（脾細(xì)胞增殖、IFN-γ 分泌量、細(xì)胞毒性等）水平增加 10～100 倍[15]。含 CpG 寡聚脫氧核苷酸的脂質(zhì)體微粒經(jīng)由淋巴注射、皮膚注射、皮下注射、滴鼻 4種途徑免疫時，遞呈細(xì)胞攝取、IgG2a 滴度都有不同程度提高[16]，反映出含 CpG 寡聚脫氧核苷酸的脂質(zhì)體微粒有較廣的適用范圍。

可電離的陽離子脂質(zhì)體是一種納米粒子，在生理 pH時顯中性。由于脂質(zhì)的疏水性，本身會形成雙層的膜脂質(zhì)體小泡，表面電荷變化小，這是與傳統(tǒng)脂質(zhì)體的不同之處。寡聚脫氧核苷酸是聚陰離子，其包裝就是依靠在酸性 pH 時兩種物質(zhì)間的靜電作用，形成含有寡聚脫氧核苷酸的中性微粒[17]。還有一些可生物降解的陽離子微粒子共載體（如聚乳酸-羥基乙酸共聚物）可依附于帶負(fù)電寡聚脫氧核苷酸與帶正電微粒子表面之間的電荷作用，小鼠試驗數(shù)據(jù)表明[18]此共載體與單一 CpG 相比，lgG2a 活性可增強 50 倍，毒素中和活性滴度增加近 10 倍。

另外，殼聚糖載體具有天然免疫原性，可以增強 CpG寡聚脫氧核苷酸對機體內(nèi)酶的穩(wěn)定性。殼聚糖-CpG 復(fù)合物進(jìn)入機體后，能被巨噬細(xì)胞表面的多糖類受體識別，激活巨噬細(xì)胞 RAW264.7；同時，也能促 NK 細(xì)胞和T 細(xì)胞活化，分泌多種細(xì)胞因子，表現(xiàn)出與CpG 寡聚脫氧核苷酸協(xié)同增效作用。殼聚糖-CpG 復(fù)合物與單純使用殼聚糖或 CpG 相比，前者抗體產(chǎn)生水平最高，持續(xù)時間長，CD4+ 細(xì)胞水平顯著增加[19]，增強了 CpG的免疫活性。因此，殼聚糖包裹CpG 寡聚脫氧核苷酸載體是一類很有應(yīng)用前景的共載體系統(tǒng)。

總之，優(yōu)良的疫苗佐劑不僅能引起較強的免疫刺激作用，還要物美價廉、易于推廣。通過其他物質(zhì)增強 CpG 免疫刺激作用，為降低 CpG 使用量進(jìn)而降低成本提供有效途徑，也為CpG 作為佐劑的研究提供新的思路和研究方向。隨著生化技術(shù)的日新月異、分子生物學(xué)和基因表達(dá)技術(shù)的飛速發(fā)展，CpG 作為佐劑的研究將會有新的發(fā)展和突破。

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