阿可拉定對(duì)子宮內(nèi)膜癌 HEC-1B 細(xì)胞雌激素受體表達(dá)的影響

彭瑤，張文謹(jǐn)，連增林，靳冉，李晉生，孟坤

子宮內(nèi)膜癌是常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅女性健康。目前治療子宮內(nèi)膜癌的方法主要有手術(shù)治療、放射治療、化學(xué)抗癌藥物及激素治療等[1]。中藥類抗癌藥物具有有效、低毒的優(yōu)勢(shì)，作為治療腫瘤的替代或輔助療法日益受到人們的關(guān)注。

阿可拉定（SNG-162）是從中藥淫羊藿中分離提取得到的單一有效成分淫羊藿黃素，以近期發(fā)現(xiàn)的新型雌激素受體亞型 ER-α36 為作用靶點(diǎn)，臨床適應(yīng)證為乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌以及雌激素受體亞型ER-α36 陽(yáng)性的相關(guān)腫瘤。本實(shí)驗(yàn)主要觀察阿可拉定及與順鉑聯(lián)合用藥對(duì)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的抗腫瘤作用，研究其對(duì) ER-α36 及ER-α66 表達(dá)的影響，探討其可能的作用機(jī)制，為子宮內(nèi)膜癌患者的臨床治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物及試劑 阿可拉定由北京珅奧基醫(yī)藥科技有限公司提供，黃色粉末狀，用 DMSO 配制成濃度為4 mmol/L的儲(chǔ)存液，4 ℃ 避光保存，使用前用含 10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液稀釋到相應(yīng)濃度，且預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：儲(chǔ)存液稀釋到相應(yīng)濃度后，細(xì)胞培養(yǎng)液中 DMSO 所占比例小于1%，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響（同無(wú) DMSO 培養(yǎng)液相比較，P ＞0.05）。順鉑（DDP）購(gòu)自中日友好醫(yī)院；胎牛血清（FBS）、DMEM（高糖）培養(yǎng)基粉末、噻唑藍(lán)（MTT）、胰蛋白酶（0.25%）為Gibco公司產(chǎn)品；二甲基亞砜（DMSO）為北京化工廠產(chǎn)品；TRIzol 為美國(guó) Invitrogen公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為美國(guó) Promega公司產(chǎn)品；PCR 引物、100 bp DNA ladder、Taq 酶、dNTPs、PCR 緩沖液、PCR 染料均在北京賽百勝基因技術(shù)有限公司合成和購(gòu)置。

1.1.2 細(xì)胞株 人子宮內(nèi)膜癌 HEC-1B 細(xì)胞購(gòu)自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.1.3 儀器 凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad公司；EDC-810 基因擴(kuò)增儀購(gòu)自北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司；HERA cell 150 恒溫 CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó) Thermo公司；倒置顯微鏡購(gòu)自日本 Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人子宮內(nèi)膜癌 HEC-1B 細(xì)胞用含 10% FBS的DMEM 培養(yǎng)液，在細(xì)胞孵育箱中 37 ℃、5% CO2及飽和濕度下培養(yǎng)，每 2～3 天傳代 1 次。

1.2.2 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞增殖狀況 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEC-1B 細(xì)胞，用 0.25%的胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，以 8×104個(gè)/ml的密度接種于96 孔板，每孔 100 μl，每個(gè)藥物濃度設(shè) 5個(gè)復(fù)孔；24 h 后吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入 100 μl 含不同濃度 SNG-162的培養(yǎng)液，藥物濃度為1、5、10、20 μmol/L；另設(shè)空白對(duì)照孔，分別繼續(xù)培養(yǎng) 24、48、72 h。每孔加入 10 μl（5 mg/ml）MTT，置于37 ℃ 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后終止培養(yǎng)，小心吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入 100 μl DMSO，輕微振蕩，充分溶解結(jié)晶。選擇 492、630 nm 波長(zhǎng)，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度值（A），計(jì)算平均吸光度值A(chǔ)（A630－A492）及細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率。抑制率=1－A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組。

1.2.3 RT-PCR 檢測(cè) ER-α36、ER-α66 基因表達(dá) HEC-1B 細(xì)胞接種在10 cm2培養(yǎng)皿中，接種密度為105個(gè)/ml，培養(yǎng)條件同上，24 h 后吸出皿內(nèi)培養(yǎng)液，加含 SNG-162的培養(yǎng)基 2.5 μmol/L、DDP（2.5μg/ml）、SNG-162 聯(lián)合 DDP（2.5 μmol/L、2.5μg/ml），另設(shè)空白對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h。用TRIzol 裂解細(xì)胞，按照 TRIzol 使用說明書提取總 RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè) A260和A280，計(jì)算A260/A280≥ 1.8 合格，計(jì)算總 RNA 濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒說明進(jìn)行 cDNA 合成。PCR 引物序列為：ER-α36 上游引物：5' TGGTTTCCTCGTG TCTAA 3'，下游引物：5' CAAAGTTTGTGGGT AGCT 3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度為219 bp；ER-α66 上游引物：5′ TCTACAGGCCAAATTCAGATAATCGA 3′，下游引物：5′ CCCTCACAGGACCAGACTCCATA 3′，產(chǎn)物長(zhǎng)度為166 bp；內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）上游引物：5' ACGGATTTGGTCGTATT GGG 3'，下游引物：5' TGATTTTGGAGGGATCTC GC 3'，產(chǎn)物長(zhǎng)度為220 bp。擴(kuò)增條件均為95 ℃ 變性 5 min；95 ℃ 變性 40 s，55 ℃ 退火 40 s，72 ℃延伸 50 s，共 39個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 延伸 10 min。使用 PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，以 1.5% 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物，以凝膠成像系統(tǒng)拍照后用quantity one 軟件進(jìn)行圖像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 阿可拉定抑制腫瘤細(xì)胞增殖

以阿可拉定處理 HEC-1B 細(xì)胞 24 h 后，細(xì)胞出現(xiàn)形態(tài)學(xué)的改變，48、72 h 后出現(xiàn)胞質(zhì)濃集、細(xì)胞膜破裂現(xiàn)象。其抑制作用隨藥物濃度和給藥時(shí)間的增加逐漸增強(qiáng)（圖 1）。根據(jù)各組抑制率及藥物濃度的對(duì)數(shù)，采用回歸方程計(jì)算出72 h 阿可拉定的IC50值為5.26 μmol/L。

圖1 不同濃度阿可拉定對(duì) HEC-1B 細(xì)胞增殖的影響Figure1 The effect of SNG-162 on HEC-1B cell proliferation

2.2 阿可拉定抑制 ER-α36 基因表達(dá)

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與空白對(duì)照組比較，SNG-162組、SNG-162 聯(lián)合 DDP組均可明顯降低 ER-α36的表達(dá)（P＜0.05）。其中，SNG-162 聯(lián)合 DDP組對(duì)該基因的影響最顯著（P＜0.01）；與空白對(duì)照組比較，SNG-162 聯(lián)合 DDP 給藥組能夠顯著抑制細(xì)胞中 ER-α66的表達(dá)（P＜0.01）。（表1，圖 2）

表1 各給藥組對(duì) HEC-1B 細(xì)胞 ER-α36、ER-α66的表達(dá)影響灰度值（ ）Table1 The gray value of ER-α36, ER-α66 in different groups ( )

表1 各給藥組對(duì) HEC-1B 細(xì)胞 ER-α36、ER-α66的表達(dá)影響灰度值（ ）Table1 The gray value of ER-α36, ER-α66 in different groups ( )

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；**P＜0.01。Note: Compared with the control group, *P＜0.05, **P＜0.01.

組別 Groups 藥物濃度 Concentration ER-α36/GAPDH ER-α66/GAPDH對(duì)照組 Control group 0 0.63±0.08 0.72±0.00 SNG-162組 SNG-162 group 2.5 μmol/L 0.35±0.02* 0.69±0.06 DDP組 DDP group 2.5μg/ml 0.57±0.05 0.84±0.04 SNG-162 + DDP組 SNG-162 combined with DDP group 2.5 μmol/L + 2.5μg/ml 0.13±0.02** 0.28±0.02**

圖2 各給藥組對(duì) HEC-1B 細(xì)胞 ER-α36、ER-α66 表達(dá)的影響Figure2 The PCR images of HEC-1B ER-α36, ER-α66 expression in different groups

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是婦科常見腫瘤之一，常分為雌激素依賴性和非雌激素依賴性兩種類型。其中雌激素依賴性子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與雌激素過度刺激及雌激素受體表達(dá)程度有關(guān)[2]。

雌激素受體蛋白由 595個(gè)氨基酸組成，分子質(zhì)量為66 kD，被稱為ER-α66。近年來(lái)，發(fā)現(xiàn) ER-α尚有一個(gè)分子質(zhì)量為35.7 kD的新亞型，被命名為ER-α36。兩者不同之處在于ER-α36 缺乏兩個(gè)轉(zhuǎn)錄激活功能區(qū) AF-1和AF-2，卻仍然保留著 DNA結(jié)合區(qū)和部分配基結(jié)合區(qū)[3]。ER-α66 為核受體，而ER-α36 為膜受體[4]，ER-α36 可激活膜介導(dǎo)的雌激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑，在細(xì)胞的內(nèi)外信息交流中發(fā)揮重要作用。

ER-α36 在細(xì)胞的生長(zhǎng)與凋亡中發(fā)揮重要作用[5]，該受體參與了子宮內(nèi)膜癌中睪酮誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖信號(hào)通路的調(diào)節(jié)[6]；部分雌激素通過細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑的快速作用來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞核基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成[7]；通過膜受體 ER-α36的介導(dǎo)，激活了PKCδ/ERK 通路且增強(qiáng)了 D1/cdk4的表達(dá)，表明ER-α36 很可能具有促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的效應(yīng)[8]。

阿可拉定是以 ER-α36 為靶點(diǎn)從中藥淫羊藿中分離提取得到的單一有效成分，能夠抑制ER-α36的表達(dá)及腫瘤細(xì)胞的增殖。順鉑為金屬鉑類絡(luò)合物，屬周期非特異性抗腫瘤藥。在細(xì)胞內(nèi)低氯環(huán)境中迅速解離，以水合陽(yáng)離子的形式與細(xì)胞內(nèi)DNA結(jié)合形成鏈間、鏈內(nèi)或蛋白質(zhì) DNA 交聯(lián)，從而破壞 DNA的結(jié)構(gòu)和功能，但對(duì) RNA和蛋白質(zhì)的合成無(wú)抑制作用[9]。順鉑抗瘤譜廣，但對(duì)子宮內(nèi)膜癌等雌激素受體相關(guān)癌癥無(wú)特異性靶點(diǎn)作用，且毒副作用強(qiáng)烈[10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿可拉定能夠顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖及ER-α36 基因的表達(dá)，與順鉑聯(lián)用能夠增強(qiáng)其作用效果。由此推測(cè)，阿可拉定抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖可能與抑制細(xì)胞中新型雌激素受體 ER-α36的基因表達(dá)有關(guān)；阿可拉定能夠增強(qiáng)順鉑的抗腫瘤作用。

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