Hsa-miR-204的生物學信息分析及研究進展

韓澤平，黎毓光，何金花

MicroRNA（miRNA）是一類由 21～25個核苷酸組成的非編碼蛋白質(zhì)的單鏈小分子 RNA，它們廣泛存在于真核生物中，在物種進化中相當保守，其表達具有組織特異性和階段特異性。miRNA 基因通常位于基因間或內(nèi)含子區(qū)域，在核內(nèi)由 RNA 聚合酶 II 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生具有帽子結(jié)構(gòu)多聚腺苷酸尾巴的初級 miRNA（primary miRNA，Pri-miRNA）。Pri-miRNA 在核酸酶 Drosha和其輔助因子 Pasha的作用下被處理成由 70個核苷酸組成的前體 miRNA（precurosor miRNA，Pre-miRNA），經(jīng) Ran-GTP 依賴的核質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白Exportin-5 轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中。另一個核酸酶 Dicer 將其剪切成約 22個核苷酸長度的miRNA 雙鏈，其中一條為成熟的miRNA 分子。成熟的miRNA 分子在細胞內(nèi)與Argonaute蛋白等形成 RNA 誘導的沉默復合體（RNA-induced silencing complex，RISC），并作用于特異 mRNA的3'UTR，從而抑制翻譯過程或直接降解 mRNA[1]。研究表明，miRNA通過在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)一些信號分子來實現(xiàn)對細胞凋亡、增殖、分化、發(fā)育和新陳代謝等的調(diào)節(jié)[2]。隨著研究的不斷深入，越來越多的證據(jù)顯示，miRNA的表達與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后密切相關[3]，它既可扮演癌基因，也可扮演抑癌基因的角色，在腫瘤組織中表達上調(diào)的miRNAs可能起到癌基因的作用，表達下調(diào)的miRNAs 可能起到抑癌基因的作用，我們以 miR-204 為探討重點，運用生物學軟件對其生物學信息及可能的調(diào)控基因進行預測，為研究其在疾病發(fā)生與發(fā)展過程中的作用提供理論依據(jù)。

1 生物學分析

1.1 miR-204的生物學信息分析

運用 UCSC和Ensembl 基因組在線瀏覽工具分析miR-204 在人類基因組中所處的位置，miR-204 定位于人類 9號染色體上 73424891-73425000 位置之間。成熟的單鏈 miRNA 分子序列為5' UUCCCUUUGUCAUCCUAUG CCU 3'（圖 1）。

1.2 miR-204的序列保守性分析

我們利用 UCSC 基因組在線瀏覽工具分析發(fā)現(xiàn)，miR-204的成熟序列在人、小鼠、大鼠、大象和金魚等脊椎動物中表現(xiàn)為高度保守（圖 2）。

圖1 運用 UCSC和Ensembl 基因組在線瀏覽工具分析 miR-204 在人類基因組中所處的位置

圖2 miR-204 在UCSC 基因組在線瀏覽工具的保守性分析

1.3 Hsa-miR-204 靶基因的篩選

認識 miRNA的作用機制，關鍵是認識 miRNA 及其靶基因的相互作用。隨著計算機生物信息學的飛速發(fā)展，miRNA 靶基因預測軟件也迅速興起并發(fā)展起來。從 2003年第一個靶基因預測軟件 miRanda 面世至今，已涌現(xiàn)出數(shù)十種靶基因預測軟件。得益于這些軟件，我們對 miRNA 靶基因的尋找減少了盲目性，節(jié)約了實驗成本，而且可以使我們能夠更有針對性地研究感興趣的miRNA，更加準確方便地闡明其在生命活動中的功能與意義。我們選擇生物信息學方法（6個主流的miRNA 靶基因分析軟件：MicroCosm、miRanda、DIANA-microT、RNAhybrid、TargetScan和RNA22）對 hsa-miR-204（humo sapiens miR-204）的靶基因進行了預測。總共預測到了 8851個 hsa-miR-204的靶基因，其中有 7個基因被 6個主流軟件共同預測為hsa-miR-204的靶基因，見表1。

2 miR-204 與腫瘤的關系

近年來，研究表明 miR-204 可能成為一種新的致癌基因或抑癌基因，它通過抑制靶 mRNA 翻譯或誘導靶mRNA 降解在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達，具有癌基因或抑癌基因的功能，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移等過程。

2.1 作為抑癌基因

Lee等[4]認為miR-204 可能是在腫瘤相關基因組座位上能抑制頭頸部鱗狀上皮細胞癌變的miRNA，在頭頸部鱗狀上皮細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）細胞株中過表達的miR-204，通過抑制腫瘤相關靶基因的表達，并在體外抑制腫瘤的黏附、遷移和侵襲，減少了實驗性肺轉(zhuǎn)移的程度，發(fā)揮抑癌基因的作用。Wu等[5]應用 miRNA 微陣列方法觀察了 10 例子宮內(nèi)膜腺癌與鄰近的非腫瘤性的內(nèi)膜組織，結(jié)果表明子宮內(nèi)膜腺癌與鄰近的非腫瘤性的內(nèi)膜組織相比 miR-205、miR-449和miR-429明顯高表達，而 miR-204、miR-99b和miR-193b 明顯低表達，miRNA 有可能在子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生中起作用，同時為子宮內(nèi)膜腺癌的診斷和治療提供一種新的思路。Chung等[6]的研究表明過表達的miR-204能抑制子宮內(nèi)膜癌細胞的遷移、侵入和細胞外的黏附，并提出FOXC1是 miR-204的靶基因，其表達與子宮內(nèi)膜癌細胞中 miR-204 成負相關。Chen等[7]將 miR-204 模擬物導入膽管癌細胞系中，發(fā)現(xiàn)外源性 miR-204 可以負向調(diào)控 BCL-2的作用，且有利于化療藥物 5-Fu 激發(fā)的細胞凋亡，此機制可能與惡性膽管癌細胞抵抗凋亡和化療有關。此外，陳磊[8]結(jié)合激光俘獲顯微切割和熒光實時定量 PCR 技術進行了人肝內(nèi)膽管細胞癌組織和正常膽管上皮組織中成熟小 RNA 表達及其功能的研究，證實了 miR-320和miR-204 表達能顯著下調(diào) MCL-1和BCL-2的蛋白水平，有效提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。張文輝等[9]采用 miRNA 芯片檢測胃遠端腺癌組織與正常組織，發(fā)現(xiàn) 47 種miRNA 在胃遠端腺癌組織中表達差異顯著；并進一步采用實時熒光定量 PCR 驗證了miR-204 在腫瘤組織中的下調(diào)表達；用生物學信息方法分析顯示：BCL-2、NR3C1和SOCS6等可能為miR-204的靶基因。結(jié)合基因芯片及實時熒光定量 PCR 技術所觀察到的miR-204 在胃遠端腺癌中表達明顯降低的狀況，考慮其可能在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起抑癌基因的作用。楊建軍等[10]發(fā)現(xiàn)在大腸癌組織及癌旁正常組織中的miRNA 存在差異表達，其中 miR-204 表現(xiàn)為下調(diào)。Carzon等[11]使用基因芯片技術比較 85 例AML 患者 miRNA 表達譜，其中 55 例npm 基因突變的AML（npm±AML）患者中 miR-204和miR-128a 低表達。其中 miR-204的靶基因是 hox 基因，表明 hox 基因表達上調(diào)的npm±AML 患者可能是由于缺乏 miR-204 所致。Mueller等[12]的研究發(fā)現(xiàn)與非侵入性同系黑色素瘤相比，高侵入性黑色素瘤的miR-204 表達明顯下調(diào)。另外，Greenberg等[13]也驗證了 miR-204的表達能抑制高侵入性黑色素瘤的轉(zhuǎn)移。Navarro等[14]利用 RT-PCR技術分析了 49 例經(jīng)典型霍奇金淋巴瘤（classical Hodgkin Lymphomas，cHL）患者的淋巴結(jié)和10 例反應性淋巴結(jié)（reactive lymph nodes，RLNs）miRNA的表達，發(fā)現(xiàn) cHL和RLNs 有 25個 miRNA 表達不同，并且有 36個miRNA的表達也不一樣。其中，miR-204 起下調(diào)作用。Huang等[15]研究報道 miR-204和它的同系物 miR-211 與調(diào)控間充質(zhì)干細胞向成骨方向分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子（runt-related transcription factor 2，Runx2）的3'UTR 區(qū)相結(jié)合，可作為Runx2 重要的內(nèi)源性負性調(diào)控物，能抑制成骨作用和促進骨髓間質(zhì)母細胞和骨髓基質(zhì)細胞的脂肪形成，從而影響其分化，這可能與抑制腫瘤的發(fā)生有關。另外，Yanaihara等[16]證實了 hsa-miR-205、hsa-miR-99b、hsa-miR-203、hsa-miR-202、hsa-miR-102和hsa-miR-204-prec等這6個 miRNA 在非小細胞肺癌、腺癌和鱗狀上皮細胞癌上的表達跟正常組織有所不同。

2.2 作為癌基因

運用定量 PCR和Western blot 對前列腺癌細胞株的RNA和蛋白進行檢測，Turner等[17]發(fā)現(xiàn)前列腺衍生上皮因子（prostate-derived epithelial factor，PDEF）的表達受結(jié)合到 3'UTR的miR-204 調(diào)控。他們進一步證明了 PDEF是腫瘤發(fā)展的一個負性調(diào)控因子，而 miR-204的表達能導致PDEF蛋白的丟失促使前列腺癌發(fā)生。Zanette等[18]比較慢性淋巴細胞白血病（CLL）和急性淋巴白血病（ALL）的miRNA 表達譜，發(fā)現(xiàn) miR-128b、miR-204、miR-218、miR-181b-1和miR-17-92 簇在ALL 中高表達。Roldo等[19]篩查了 12 例非胰腺腫瘤組織和胰腺原發(fā)腫瘤組織中miRNA的表達譜后，發(fā)現(xiàn)有一共同的miRNA 表達模式能夠區(qū)分腫瘤和正常胰腺組織。而 miR-204 主要表達于有胰島素分泌功能的胰島素瘤中。

綜上所述，miR-204 在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中扮演著癌基因或抑癌基因的作用，這種作用是通過調(diào)節(jié)靶基因而實現(xiàn)的。

3 miR-204 與其他疾病的關系

最近，研究發(fā)現(xiàn) miR-204 在其他疾病中也有不同程度的表達。miR-204 在正常的視網(wǎng)膜色素上皮細胞（retinal pigment epithelium，RPE）、睫狀體和脈絡叢中高表達，而且參與RPE和睫狀體生成腦脊液和房水調(diào)控[20]。高玉[21]采用 miRNA 芯片檢測糖尿病組和對照組小鼠視網(wǎng)膜中168個 miRNAs的表達，發(fā)現(xiàn)糖尿病組的miR-182、miR-96和miR-204等表達顯著上調(diào)。Li等[22]證實miR-204 廣泛調(diào)節(jié)人小梁網(wǎng)細胞的凋亡、損傷蛋白的儲存、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)反應性壓力和炎癥介質(zhì)的表達。Xiao等[23]采用RT-PCR和Western blot 分別檢測心肌細胞在缺血-再灌注情況下 miR-204和LC3-II蛋白的表達，結(jié)果顯示 miR-204低表達、LC3-II 表達升高，并驗證了在心肌缺血再灌注損傷中 miR-204 通過調(diào)控 LC3-II蛋白表達從而調(diào)節(jié)細胞自溶作用。Courboulin等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）患者體內(nèi)，只有肺部和肺動脈中的miR-204 被抑制，而且直接與PAH的嚴重程度相關。因此，他們認為，miR-204能作為診斷 PAH的可靠生物標記物，恢復 miR-204的表達將可能是 PAH的一種新的治療方法。

4 展望

miRNAs 作為一類內(nèi)源性非編碼的小 RNAs，通過與靶基因序列特異性相互作用，在轉(zhuǎn)錄或翻譯水平調(diào)節(jié)相關基因表達，參與發(fā)育、增殖、分化、凋亡等多種生物學過程。與腫瘤相關的miRNAs的研究是近年的研究熱點，綜合上述研究，miR-204的表達與頭頸部鱗狀上皮細胞癌、子宮內(nèi)膜癌、膽管癌、胃癌、大腸癌、白血病、前列腺癌、黑色素瘤、肺癌和胰腺腫瘤等的發(fā)生發(fā)展密切相關。雖然對 miRNA的認識已取得了很大的進展，但是對 miR-204 本身的研究及其在腫瘤中的研究仍然處于起步階段，除了需要繼續(xù)尋找新的與miR-204 相關的腫瘤外，許多已知 miR-204的功能也有待進一步的研究和闡明，同時 miR-204 自身的表達與功能受哪些因素調(diào)控，miR-204是直接參與腫瘤的生成還是僅僅作為一種有差異的受調(diào)節(jié)物，不同的腫瘤組織中為何表達可以完全相反等很多問題都有待我們進一步的研究與探索。

要深入探討 miR-204 與腫瘤的關系，確定其靶基因是關鍵。自從第一個 miRNA 靶基因預測軟件問世以來，至今已有數(shù)十種專業(yè)軟件被用于預測 miRNA 靶基因，這些軟件的計算法則通常是：①種子序列（miRNA 5' 端 2～8 nt）和靶基因 3' 端 UTR 區(qū)之間的互補程度；②miRNA靶基因二聚體的自由能大小，即熱力學穩(wěn)定性；③靶基因非翻譯區(qū)序列跨物種保守性；④miRNA 靶位點處不應有復雜二級結(jié)構(gòu)；⑤miRNA 5' 端與靶基因的結(jié)合能力強于3' 端等。但是這些預測軟件往往對于已知的miRNA 靶基因有著很高的預測特異性和敏感度，對于未知的靶基因預測各預測軟件之間交集很小，假陽性率也較高[25]。Allen等[26]嘗試把多種方法組合后進行基因預測，發(fā)現(xiàn)使用某一種基因預測軟件很難獲得理想的結(jié)果，但多種基因預測軟件綜合在一起后，則可以大大提高預測的準確性及合理性。我們利用 6個miRNA 靶基因預測軟件對 miR-204 進行靶基因預測，結(jié)果顯示 CDH2、KHDRBS1、ATF2、MYO10、EZR、CONT1和PITX2 這 7個基因可能為miR-204的靶基因，使下一步的研究更加有針對性。這樣既提高了預測的準確性，同時也大大縮短了靶基因的數(shù)量，大幅度地節(jié)省了實驗室驗證的工作量。在基因檢測如此火熱的時代，相信在不久的將來會出現(xiàn)更高效準確的miRNA 靶基因預測工具，為miRNA的研究工作提供可靠的基因預測信息。在下一步的研究工作中，我們將結(jié)合上述被預測的7個靶基因，更深一層地探索 miR-204 與腫瘤的關系，相信在不久的將來，我們將能深入地認識腫瘤的發(fā)生機制，為腫瘤的診斷、治療提供新的視野。

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