以次黃嘌呤核苷酸脫氫酶為靶點的藥物研發(fā)

張大軍，仲兆金，李卓榮

次黃嘌呤核苷酸脫氫酶（inosine 5′-monophosphate dehydrogenase，IMPDH）是嘌呤生物合成的關鍵酶，它將次黃嘌呤核苷酸（IMP）氧化為黃嘌呤核苷酸（XMP），XMP在GMP 合成酶的催化下生成 GMP（圖 1）。該合成途徑被稱作是鳥嘌呤核苷酸的經(jīng)典合成途徑，IMPDH的催化反應在該合成途徑中起到限速作用。鳥嘌呤核苷酸對于DNA和RNA的合成是重要的酶底物，在細胞的生長分化、凋亡及在細胞信號傳導中具有重要作用[1]。IMPDH的催化反應與細胞增殖有密切關系，抑制 IMPDH 將導致鳥嘌呤核苷酸缺乏，DNA 合成受阻，使細胞靜止于G1期。

IMPDH 在生物體中廣泛表達，存在于人和其他哺乳動物的各個器官中，也存在于微生物體內(nèi)。研究表明，在培養(yǎng)細胞的細胞質(zhì)和細胞核中都能找到 IMPDH。人類細胞中含有兩種IMPDH，即兩個相近的同工酶 IMPDH1和IMPDH2，每個同工酶都是由 514個氨基酸殘基組成，具有 84%的氨基酸序列同源性。IMPDH1和IMPDH2 兩種基因有很大不同，IMPDH1 活性是構成性表達，其表達通常在相對 IMPDH2 較低的水平中，而且不受細胞增殖、分化等影響。IMPDH2 顯示誘導性表達，是增殖細胞中的高度正調(diào)節(jié)，在增殖細胞和腫瘤細胞中的表達水平不斷增強。對于病毒的侵襲，細胞內(nèi) IMPDH2的表達水平會提高。IMPDH2 基因在生物體內(nèi)發(fā)揮不可缺少的調(diào)節(jié)作用，將小鼠的IMPDH1 基因敲除，其能夠存活，但若將小鼠的IMPDH2 基因敲除，則小鼠死亡[2]。

以 IMPDH 為靶點的藥物研究比較廣泛，研究結果顯示，IMPDH 抑制劑在免疫抑制、抗腫瘤、抗病毒及抗菌等方面均有良好的應用前景，相關藥物的研發(fā)取得了重要進展，有些藥物已經(jīng)在臨床治療中發(fā)揮著重要作用。本文就近年來以 IMPDH 為靶點的藥物的作用機制及研發(fā)進展做一綜述。

1 免疫抑制

不像人體其他細胞可以通過嘌呤補救合成途徑彌補缺乏的鳥嘌呤核苷酸，淋巴細胞的增殖需要大量的鳥嘌呤核苷酸，但其不能夠通過旁路途徑合成，幾乎完全依賴于鳥嘌呤核苷酸的從頭合成途徑，淋巴細胞的活化同時伴隨著IMPDH 表達的增加。因此，抑制 IMPDH 活性能夠顯著限制淋巴細胞的增殖，從而達到免疫抑制的目的。具有免疫抑制活性的IMPDH 抑制劑的結構如圖 2 所示。

咪唑立賓（圖 2-1）是一種具有咪唑核苷類結構的天然產(chǎn)物，為IMPDH 競爭性抑制劑，在臨床上用于防止器官移植產(chǎn)生的排斥反應。咪唑立賓結合到 IMP 底物結合位點發(fā)揮作用，干擾細胞因子受體的表達，拮抗細胞因子對淋巴細胞的激活作用。在兔及羊紅細胞進行免疫的實驗中，能抑制由于初次應答及二次應答而生成抗體的過程。在用狗及人外周血淋巴細胞進行的體外實驗中能抑制各種致有絲分裂因子引起的胚細胞樣轉(zhuǎn)變反應。在豚鼠巨噬細胞的游走抑制試驗中，能減弱腹腔內(nèi)滲出細胞的游走，使鳥苷酸合成減少，細胞內(nèi) RNA和DNA 合成減少，可阻止增殖的淋巴細胞由 G1期進展為S 期。抑制抗體及記憶 B 細胞和記憶輔助性 T 細胞的產(chǎn)生，可延長移植物的存活。聯(lián)合應用環(huán)孢素和咪唑立賓可以協(xié)同增強免疫抑制作用[3]。

圖1 IMPDH 催化鳥嘌呤核苷酸的合成

圖2 具有免疫抑制活性的IMPDH 抑制劑

霉酚酸（MPA，圖 2-2）是一個可逆的、非競爭性哺乳動物 IMPDH 抑制劑。其前藥霉酚酸酯作為一種高特異性的淋巴細胞抑制劑已廣泛應用于各種實體器官的移植，能夠阻止 T 淋巴細胞的分裂及B 細胞中抗體的形成。霉酚酸酯經(jīng)胃腸道吸收入血并迅速水解為活性成分霉酚酸，大部分MPA和血漿蛋白結合，少量以游離形式發(fā)揮免疫抑制作用。MPA 可以選擇性、非競爭性、可逆性抑制 IMPDH 活性。因淋巴細胞不具備通過補救途徑進行鳥嘌呤核苷酸合成的能力，完全依賴鳥嘌呤核苷酸從頭合成途徑，因此 MPA 對淋巴細胞 IMPDH的抑制導致了細胞內(nèi)鳥嘌呤核苷酸耗竭，間接阻礙了 DNA 合成，從而限制淋巴細胞的增殖以達到免疫抑制目的。霉酚酸通過結合 IMPDH 酶上的NAD結合位點發(fā)揮其對 IMPDH 酶的抑制作用，霉酚酸對人體IMPDH1的親和力動力學參數(shù) Ki 為40 nmol/L，對IMPDH2的親和力動力學參數(shù) Ki 為10 nmol/L[4]。然而在使用的過程中，MPA 副作用較大，患者在用藥過程中需要進行監(jiān)測。研究顯示，患者在服用 MPA 后IMPDH1 基因和IMPDH2 基因表達上調(diào)[5]。深入研究 MPA 對 IMPDH表達的影響，對改善 MPA的藥效和減小其副作用仍然具有重要意義。MPA 治療的患者往往涉及聯(lián)合用藥以減少服用MPA 所引起的毒副作用。故開發(fā)新結構的毒副作用較小的IMPDH 抑制劑具有重要意義。

美國 Vertex 制藥公司基于IMPDH的結構設計了一系列苯唑脲類化合物。作為IMPDH 非競爭性抑制劑，merimepodib（VX-497，圖 2-3）與霉酚酸均在IMP 與IMPDH 形成復合物后發(fā)揮作用。唑基團與GLY326 形成氫鍵，MPA的甲基位置由苯唑類化合物甲氧基占據(jù)，脲結構與Asp274 形成氫鍵，而 MPA 與苯唑脲分子及IMP 均能夠形成 π-π 堆積作用，這些相互作用對化合物的效力至關重要（圖 3和圖 4）[6]。VX-497能夠特異地、可逆地、非競爭性作用于淋巴細胞的IMPDH，對人類IMPDH1的抑制動力學參數(shù) Ki 為10 nmol/L，對 IMPDH2的抑制動力學參數(shù) Ki 為7 nmol/L。能夠抑制淋巴細胞的增殖，臨床應用于免疫抑制相關疾病的治療。

圖3 MPA（綠色）與中國倉鼠 IMPDH2（同人類 IMPDH2類似）模擬結合圖

圖4 VX-497（藍色）與中國倉鼠 IMPDH2 模擬結合圖

2 抗腫瘤

在腫瘤細胞中，細胞不斷增殖需要大量的鳥嘌呤核苷酸，而 IMPDH 在腫瘤增殖細胞中表達明顯升高，故抑制IMPDH 即能夠抑制腫瘤細胞鳥嘌呤核苷酸的合成，令腫瘤細胞中鳥嘌呤核苷酸枯竭，而正常體細胞因不需要大量的鳥嘌呤核苷酸，故受 IMPDH 抑制劑的影響較小。這就為IMPDH 抑制劑應用于抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了理論基礎。抗腫瘤 IMPDH 抑制劑的結構如圖 5 所示。

噻唑呋林（圖 5-5）是 IMPDH的非競爭性抑制劑，臨床上用于治療慢性粒細胞性白血病。噻唑呋林為前藥，需要代謝活化成其活性形式——噻咪4-羧酰胺腺嘌呤雙核苷酸（TAD）才能對磷酸肌苷脫氫酶（IMPDH）發(fā)生強力非競爭性抑制，從而阻止鳥嘌呤核苷酸的產(chǎn)生。實驗證實，噻唑呋林具有極強的誘導白血病細胞 K562 凋亡的作用，但其神經(jīng)毒性較大，并存在耐藥問題[7]。

MPA能夠誘導淋巴細胞壞死，抑制腫瘤細胞生長。研究顯示，MPA能夠誘導 PC-3和DU145 前列腺癌細胞分化。在臨床試驗中，MPA 對多發(fā)性骨髓瘤患者顯示了較小的毒性，目前正處于II 期臨床試驗[8]。為了降低毒性和獲得更好的藥代動力學參數(shù)，研究人員合成了一系列霉酚酸腺嘌呤核苷酸，以減少葡糖醛酸化，改善化合物的藥理性質(zhì)。代表化合物 C2-MAD（圖 5-6）作用于IMPDH 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸結合位點，對 IMPDH的Ki 值約為350 nmol/L，顯示了抗白血病效果和誘導細胞分化的能力，效果強于MPA。在濃度為1.5 μmol/L 時，C2-MAD能夠誘導 65%的白血病細胞 K562 成熟，未增殖的細胞能夠產(chǎn)生血紅蛋白。在小鼠模型中，C2-MAD 對慢性粒細胞性白血病的治療效果優(yōu)于噻唑呋林，而且具有更小的毒性，對耐噻唑呋林的癌細胞仍然具有效力，是一個有前景的治療慢性粒細胞白血病的候選藥物[7]。研究人員對化合物進一步改造，發(fā)現(xiàn)了活性更高的化合物（圖 5-7，圖 5-8）。

同時抑制 IMPDH和組蛋白去乙?；福℉DAC）是一種新的抗腫瘤策略。SAHA（圖 5-9）能夠同時抑制IMPDH和HDAC，其對人類 IMPDH1和IMPDH2的Ki值分別為5.0 μmol/L和1.7 μmol/L。對 HDAC的IC50值為0.06 μmol/L，被批準治療皮膚 T 細胞淋巴瘤。SAHA 與伊馬替尼合用能夠?qū)δ鸵榴R替尼的白血病細胞產(chǎn)生療效。MAHA（圖 5-10）對 IMPDH的抑制活性與MPA 相當，其對人類 IMPDH1和IMPDH2的Ki 值分別為70 nmol/L和30 nmol/L，而其對 HDAC的抑制活性比 MPA 強，IC50值為5.0 μmol/L，MAHA 在濃度為0.25 μmol/L 時能夠誘導 75% 白血病細胞 K562 分化，而相同條件下，SAHA 誘導 47% K562 分化，具有更強的抗腫瘤活性[9]。

圖5 抗腫瘤 IMPDH 抑制劑

AVN-944 （圖 5-11）是一個結構新穎的、特異性的非競爭性 IMPDH 抑制劑，在針對腫瘤治療的I 期臨床試驗中顯示其對健康男性受試者具有良好的耐受性。其對人IMPDH的抑制活性 Ki 為6～10 nmol/L。該化合物誘導細胞周期阻滯在S 期，誘導多發(fā)性骨髓瘤細胞株蛋白酶凋亡，還能抑制人類前列腺癌細胞的生長，并且導致腫瘤細胞的分化和死亡[10]。在男性中，前列腺癌是僅次于肺癌的癌癥死因。AVN-944 有望成為一個很有前景的前列腺癌治療藥物。AVN-944 與吉西他濱聯(lián)合用于胰腺癌的治療已進入臨床試驗。AVN-944 與IMPDH 模擬結合圖如圖 6 所示。

圖6 AVN-944（紫色）與中國倉鼠 IMPDH2 模擬結合圖

研究人員還篩選了一系列天然產(chǎn)物（圖 7）用于抗腫瘤研究?；衔?2264A（圖 7-12）和2264B（圖 7-13）對 IMPDH2 具有明顯的抑制活性，其 IC50值分別為70 μmol/L和12 μmol/L，這兩個化合物均能夠抑制淋巴細胞的增長。從海綿中分離得到的不飽和脂肪酸（圖 7-14）對哺乳動物 IMPDH2的IC50約為1 μmol/L，helenalin（圖 7-16）顯示的抗癌活性也與IMPDH 相關?；衔?17（圖 7-17）對 IMPDH的IC50約為15 nmol/L，這些天然產(chǎn)物與IMPDH的作用機制仍在進一步確證。

3 抗病毒

病毒的增殖需要大量的鳥嘌呤核苷酸，而病毒自身不能合成鳥嘌呤，必須依靠宿主細胞的鳥嘌呤核苷酸作為基礎物質(zhì)。若對宿主細胞的IMPDH 進行抑制，降低宿主細胞內(nèi)的鳥嘌呤核苷酸水平，就能夠明顯起到抗病毒作用。

利巴韋林（圖 8）又名病毒唑，是廣譜強效的抗病毒藥物，目前廣泛應用于病毒性疾病的防治。利巴韋林還可以與干擾素（IFN-α）聯(lián)用治療慢性丙型肝炎。利巴韋林臨床上也被用作抗呼吸道合胞體病毒藥物，市場上稱作 virazole。研究表明，利巴韋林具有明顯的IMPDH 抑制活性。利巴韋林在用藥的過程中對免疫系統(tǒng)平衡會造成影響。大劑量長期使用可引起白細胞減少、貧血、血清轉(zhuǎn)氨酶和膽紅素升高，并可引起膽血紅蛋白下降[11]。

如前所述，VX-497是一個可逆的、非競爭性 IMPDH抑制劑，其不但具有免疫抑制活性，同樣也是一個抗病毒候選藥物。在對被 DNA 病毒（乙型肝炎病毒、人巨細胞病毒和單純皰疹病毒）和RNA 病毒（呼吸道合胞病毒副流感-3 病毒、牛病毒性腹瀉病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦脊髓炎病毒、登革熱病毒、黃熱病毒、柯薩奇 B3 病毒、腦炎心肌炎病毒和A 型流感病毒）感染的體外細胞實驗中，VX-497的抗病毒活性是利巴韋林的17～186 倍，說明 VX-497 具有強效廣譜抗病毒作用。VX-497 與干擾素合用治療丙型肝炎的實驗中，也顯示出比利巴韋林與干擾素合用更好的效果[12]。

過去幾年，切昆貢亞熱疫情爆發(fā)的報道受到廣泛關注。而 MPA 對切昆貢亞病毒的實驗顯示，MPA能夠誘導切昆貢亞病毒凋亡。在MPA 為10 μmol/L 時，對切昆貢亞病毒具有較強的抑制作用[13]。

4 抗寄生蟲

寄生蟲的增殖需要大量的鳥嘌呤核苷酸，特異地抑制寄生蟲 IMPDH，即能夠抑制寄生蟲的增殖。原核生物對 MPA表現(xiàn)出明顯的耐受性，也為開發(fā)選擇性的寄生蟲 IMPDH抑制劑提供了實驗依據(jù)。

圖7 具有 IMPDH 抑制活性的天然產(chǎn)物

圖8 利巴韋林的化學結構

隱孢子蟲是一類重要人類病原體，能夠引起腸道疾病，并且可能導致人體免疫力低下而威脅人的生命。這種寄生蟲引起的疾病在發(fā)展中國家尤為嚴重，尤其危害兒童的健康。針對這一類疾病并沒有疫苗，人群可能通過飲水而大規(guī)模爆發(fā)疾病，而目前并沒有特異的藥物對其進行治療，現(xiàn)有藥物并不足以應付疾病的挑戰(zhàn)。隱形孢子蟲不能夠通過旁路途徑利用鳥嘌呤，研究人員發(fā)現(xiàn)了一系列化合物能夠特異性地抑制隱孢子蟲 IMPDH，對寄生蟲的IMPDH 抑制活性明顯高于人類 IMPDH 抑制活性，很有希望成為治療隱孢子蟲病的理想藥物[14]。

對隱孢子蟲 IMPDH 有抑制活性的化合物結構多樣（圖 9），但也具有相似的特點?；衔?19和化合物 20對隱孢子蟲 IMPDH的抑制活性分別約為0.76 μmol/L和1.6 μmol/L。兩個化合物都含有萘基團和取代苯基，且均含有酰胺基團。化合物 19 對人類 IMPDH210%的抑制活性均小于0.5 μmol/L，具有很好的選擇性。而將萘環(huán)換成喹啉環(huán)，對活性影響并不顯著，化合物 21 對寄生蟲的IMPDH抑制活性約為0.8 μmol/L。將喹啉環(huán)以苯環(huán)代替，化合物 22對寄生蟲的IMPDH 抑制活性 3.3 μmol/L，活性略有下降?；衔?23 與上述結構差異較大，但結構中仍保留有酰胺基團，對寄生蟲的IMPDH 抑制活性為19 μmol/L，將化合物21的喹啉環(huán)以化合物 24 中的雜環(huán)取代，對寄生蟲IMPDH 抑制活性為5.4 μmol/L，活性下降?；衔?25含有苯并咪唑和噻唑基團，對寄生蟲 IMPDH 抑制活性為1.6 μmol/L，化合物 26 對寄生蟲 IMPDH 抑制活性為1.4 μmol/L，而化合物 27 為氧連接的對稱喹喔啉二酮結構，對寄生蟲 IMPDH 抑制活性為5.9 μmol/L，化合物 28 分子較小，但仍具有較強活性，對寄生蟲 IMPDH 抑制活性為1.6 μmol/L[15]。

5 抗菌

微生物和哺乳動物的同工酶大約有 30%～40% 序列相同。因此，同一個抑制劑對微生物和哺乳動物 IMPDH 具有不同的抑制活性。MPA 對哺乳動物 IMPDH的抑制活性就明顯高于其對微生物 IMPDH的抑制活性。

圖9 能夠選擇性抑制隱形孢子蟲 IMPDH的化合物

多重耐藥菌的出現(xiàn)對現(xiàn)有抗生素提出了嚴峻考驗，對萬古霉素具有耐藥性的金黃色葡萄球菌也已經(jīng)出現(xiàn)，耐藥的肺炎鏈球菌、腸球菌、肺炎克雷伯菌及幽門螺旋桿菌越來越普遍[16]。一旦抗生素大批失效，人類可能面對可怕的災難。故尋找新的抗生素靶點，研發(fā)新的抗生素變得尤為重要。而IMPDH 用于抗菌是一個全新的靶點，全新的作用機制令人充滿期待。

6 問題與展望

綜上所述，以 IMPDH 為靶點的藥物已廣泛應用于免疫抑制、抗腫瘤、抗病毒治療，在臨床治療上發(fā)揮著重要作用，其應用和聯(lián)合應用不但解決了藥物的耐受性問題，而且取得了更好的療效。但目前應用的IMPDH 抑制劑也存在一定的副作用，如胃腸道反應、白細胞減少等癥狀，一些患者的用藥還需進行監(jiān)測。故開發(fā)高效低毒的IMPDH 抑制劑依然具有重要意義。針對不同的病癥，對 IMPDH1和IMPDH2 進行選擇性抑制，開發(fā)特異性的抑制劑，不但可以減小毒副作用，同樣能夠提高藥效。IMPDH 抑制劑應用于抗寄生蟲和抗菌方面是一個新的領域，具有廣闊的前景。應用計算機技術，結合不同物種特定的IMPDH的結構特點，開發(fā)出以 IMPDH 為靶點的特效藥，依然是藥物工作者面臨的挑戰(zhàn)。

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