鏈霉菌I06A-00625發(fā)酵產(chǎn)物的提取分離、結(jié)構(gòu)鑒定及活性研究

賈貝，何寧，趙莉莉，余利巖，蔣忠科，姜蓉

銅綠色假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是假單胞菌屬中的代表菌種，是一種重要的院內(nèi)感染條件致病菌，常常感染免疫力低下的病人，引起菌血癥、肺炎、泌尿系統(tǒng)感染。由于銅綠色假單胞菌外膜通透性低并存在著外排多種物質(zhì)的主動(dòng)外排系統(tǒng)（active efflux systems），使得其具有先天的多重耐藥性[1]，臨床治療十分困難，一旦感染，死亡率很高，已經(jīng)成為臨床醫(yī)生面臨的治療難題之一。因此，迫切需要發(fā)現(xiàn)新的抗銅綠色假單胞菌的藥物。

前期的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)鏈霉菌 I06A-00625（cpcc201504）的發(fā)酵液樣品具有抑制銅綠色假單胞菌生長(zhǎng)的活性。本研究通過(guò)對(duì) I06A-00625 發(fā)酵液抗真菌組分的分離純化，得到 6個(gè)單一化合物，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析并進(jìn)行抗菌活性研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 鏈霉菌 I06A-00625、銅綠色假單胞菌（ATCC 29212）、黑曲霉菌（BM，ATCC 16404）和白色念珠菌（CA，ATCC 10231）均由本所菌種中心提供。

1.1.2 種子培養(yǎng)基與發(fā)酵培養(yǎng)基 含葡萄糖 5 g，酵母膏 5 g，蛋白胨 5 g，牛肉膏 5 g，玉米漿 4 g，黃豆餅粉 10 g，碳酸鈣 4 g，氯化鈷 0.02 g，淀粉20 g，水 1 L，pH 7.2。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器 大孔吸附樹脂 X-5和葡聚糖凝膠 LH-20 為上海生化試劑廠產(chǎn)品；Agilent 1200A 型高效液相色譜儀和半制備色譜柱（9.4 mm×250 mm，5 μm）均為美國(guó)安捷倫公司產(chǎn)品；UV 2550 型紫外光譜儀為日本 Shimadzu公司產(chǎn)品；Varian VNS-600 型 600M 核磁共振儀為瑞士瓦里安公司產(chǎn)品；LTQ-Orbitrap 質(zhì)譜儀為美國(guó)賽默飛世爾公司產(chǎn)品；高效液相用色譜純乙腈為美國(guó) SK Chemicals公司產(chǎn)品；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 菌種發(fā)酵 菌種I06A-00625 于瓊脂斜面培養(yǎng)基上 27 ℃ 培養(yǎng) 7 d，接種于100ml 種子培養(yǎng)基中，180 r/min，27 ℃ 振蕩培養(yǎng) 48 h。以 5%的接種量轉(zhuǎn)種至發(fā)酵培養(yǎng)基中，27 ℃，180 r/min 振蕩培養(yǎng) 96 h，發(fā)酵終點(diǎn) pH 7.5。

1.2.2 提取分離 發(fā)酵液離心，棄去菌絲體，上清液過(guò) X-5 大孔吸附樹脂，分別用無(wú)鹽水、10%、30%、50%、80% 丙酮洗脫。

對(duì)各部分洗脫液進(jìn)行多種抗菌活性追蹤，10%丙酮洗脫液具有較好的抗銅綠色假單胞菌活性，將其濃縮后上葡聚糖凝膠 LH-20 柱，以 30% 甲醇洗脫，活性組分進(jìn) HPLC 純化，液相條件：流動(dòng)相 18% 乙腈，流速 1ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng) 230 nm。收集保留時(shí)間為13.8 min的組分。

50% 丙酮洗脫液具有較好的抗真菌活性，濃縮后上葡聚糖凝膠 LH-20 柱，收集黃色、淺黃兩個(gè)色帶。淺黃色帶進(jìn) HPLC 分析，液相條件：流動(dòng)相 30% 乙腈，流速 1ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng) 215 nm，分別在保留時(shí)間 26.1和28.5 min 時(shí)有兩個(gè)組分。黃色色帶進(jìn) HPLC 分析，液相條件：流動(dòng)相 30%乙腈 35 min，37% 乙腈 20 min，流速 1ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng) 304 nm，在保留時(shí)間 46.8、47.8和55.3 min出現(xiàn) 3個(gè)活性組分。

1.2.3 抗菌活性測(cè)定 采用紙片瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定抗菌活性，用白色念珠菌和黑曲霉菌作為檢定菌。將白色念珠菌和黑曲霉菌按 1%的比例接種于LB 培養(yǎng)基上。將加有 40μg/ml 樣品的5 mm紙片貼于平板上，于37 ℃ 恒溫箱中培養(yǎng) 24 h 后測(cè)量抑菌圈的大小。

2 結(jié)果

2.1 分離純化結(jié)果

10% 丙酮洗脫液分離得到 1個(gè)具有抗銅綠色假單胞菌的活性組分，命名為I06A625A，經(jīng)過(guò)初步結(jié)構(gòu)鑒定確定其為核苷類化合物，具體結(jié)構(gòu)正在解析。

50% 丙酮洗脫液淺黃、黃色兩個(gè)色帶共收集得到 5個(gè)單一組分，依次命名為206A、206B、206C、206D和206E。

2.2 活性化合物結(jié)構(gòu)鑒定

206E 為白色無(wú)定形粉末，易溶于甲醇、乙腈、DMSO，不溶于氯仿、水。ESI-MS[M+H]+(m/z)：696.2，根據(jù)高分辨質(zhì)譜并結(jié)合1H-NMR和13C-NMR 數(shù)據(jù)確定分子式為C35H53NO13，其紫外吸收分別在291、305、319 nm 波長(zhǎng)處有最大吸收，與四烯類抗生素的紫外特征吸收一致，可以斷定其為四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。根據(jù)1H-NMR和13C-NMR 譜核磁數(shù)據(jù)，查閱相關(guān)文獻(xiàn)[2-4]后確定其為Tetramycin A，結(jié)構(gòu)式見圖 1。

206C 為白色無(wú)定形粉末，易溶于甲醇、乙腈、DMSO，不溶于氯仿、水。ESI-MS[M+H]+(m/z)：712.3，根據(jù)高分辨質(zhì)譜并結(jié)合1H-NMR 數(shù)據(jù)確定分子式為C35H53NO14，根據(jù)紫外吸收特征確定為四烯類抗生素，與206E 為同一系列化合物，根據(jù)核磁數(shù)據(jù)，查閱相關(guān)文獻(xiàn)[2-4]后確定其為Tetramycin B，結(jié)構(gòu)式見圖 1。

圖1 206E、206C、206D的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure1 Chemical structure of 206E, 206C and 206D

206D 為白色無(wú)定形粉末，易溶于甲醇、乙腈、DMSO，不溶于氯仿、水。ESI-MS[M+H]+(m/z)：682.3，根據(jù)高分辨質(zhì)譜并結(jié)合1H-NMR 數(shù)據(jù)確定分子式為C34H51NO13，與206E 為同一系列化合物，根據(jù)核磁數(shù)據(jù)，查閱相關(guān)文獻(xiàn)[2-4]后確定其為Tetrin A，結(jié)構(gòu)式見圖 1。

206A 為白色無(wú)定形粉末，易溶于甲醇、氯仿、乙腈等有機(jī)溶劑，由 ESI-MS 確定分子量為242，分子式為C14H14N2O2，紫外最大吸收波長(zhǎng)：224和294 nm，對(duì)其1H-NMR和13C-NMR 各峰進(jìn)行歸屬后確定其為化合物 (Z)-3-benzylidenehexahydro,pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione[5-6]。結(jié)構(gòu)式見圖 2。

圖2 206A的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure2 Chemical structure of 206A

206B 為白色無(wú)定形粉末，易溶于甲醇、氯仿、乙腈等有機(jī)溶劑，由 ESI-MS 確定分子量為193，分子式為C11H15NO2，紫外最大吸收波長(zhǎng)：215和275 nm，且在226 nm 處有肩峰，對(duì)其1H-NMR和13C-NMR 各峰進(jìn)行歸屬后確定其為化合物N-(4-methoxyphenethyl) acetamide。結(jié)構(gòu)式見圖 3。

2.3 活性測(cè)定

2.3.1 抗銅綠色假單胞菌活性 采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行活性測(cè)定，活性組分 I06A625A 對(duì)銅綠色假單胞菌表現(xiàn)出了抑制活性，但其 MIC 值大于512μg/ml。

2.3.2 抗真菌活性 采用紙片擴(kuò)散法測(cè)量抑菌圈直徑，由表1 可知分離得到的3個(gè)四烯類抗生素對(duì)白色念珠菌及黑曲霉均有抑制活性。

圖3 206B的化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure3 Chemical structure of 206B

表1 化合物的抗真菌活性Table1 Antifungal activity of 5 purified compounds

3 討論

本實(shí)驗(yàn)分離得到的化合物 206E和206C 分別為四烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素 Tetramycin A和B，四烯類大環(huán)內(nèi)酯類抗生素普遍具有較好的抗真菌作用[7]。Tetramycin 最早從 Streptomyces noursei的代謝產(chǎn)物中分離得到[8]，隨后，Radics等[3]利用核磁共振手段確定了 Tetramycin A和B的結(jié)構(gòu)，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)多種真菌具有較強(qiáng)的抑制作用，本研究也證實(shí)了其對(duì)白色念珠菌和黑曲霉菌的抑制作用。另外本研究中還發(fā)現(xiàn) Tetramycin A和B 對(duì)Pseudomonas aeruginosa的SecA蛋白的ATPase 具有抑制活性，但其抑制酶活作用的機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

在以 3-ylidene-pyrazine-2,5-diones 為母核的衍生物合成研究中，化合物 (Z)-3-benzylidenehexahydro,pyrrolo[1,2-a]pyrazine-1,4-dione（206A）已被多次報(bào)道[9]，但卻是首次從天然產(chǎn)物中分離得到，從生源角度看可以認(rèn)為是兩個(gè)氨基酸形成的環(huán)肽。

N-(4-methoxyphenethyl)acetamide（206B）被報(bào)道為合成異喹啉類物質(zhì)的中間體[10]，此次在微生物代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)，表明其很有可能也是生源途徑合成異喹啉類的中間物質(zhì)。Sachchidanand等[11]還研究過(guò)其作為先導(dǎo)化合物在蛋白水平上對(duì) p53穩(wěn)定性的影響，并修飾了其構(gòu)型。

鏈霉菌 I06A-00625 產(chǎn)生的多種活性組分屬于不同種類的抗生素，既有抗銅綠色假單胞菌的核苷類化合物，又同時(shí)產(chǎn)生抗真菌的四烯類化合物，這種同一株菌可以產(chǎn)生不同種類抗生素的現(xiàn)象也值得我們關(guān)注。

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