柱前衍生RP-HPLC法同時測定天花粉中天門冬氨酸與谷氨酸的含量

潘健，劉文，陳文秋，余敏靈（樂山市食品藥品檢驗所，四川樂山614000）

柱前衍生RP-HPLC法同時測定天花粉中天門冬氨酸與谷氨酸的含量

潘?。瑒⑽?，陳文秋，余敏靈#（樂山市食品藥品檢驗所，四川樂山614000）

目的：建立同時測定天花粉中天門冬氨酸與谷氨酸含量的方法。方法：采用柱前衍生反相高效液相色譜法。在堿性條件下，氨基酸與異硫氰酸苯酯反應，生成異硫氰酸苯-氨基酸的衍生物。色譜柱為Venusil-AA氨基酸分析柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相A為0.05mol·L－1醋酸鈉溶液（pH 6.5）、B為乙腈-水（80∶20，V/V），梯度洗脫，檢測波長為248nm。結果：天門冬氨酸與谷氨酸的進樣量分別在12.16～486.40ng（r＝0.9996）與21.08～843.20ng（r＝0.9997）范圍內與各自峰面積積分值呈良好的線性關系；平均加樣回收率分別為98.5%（RSD＝1.43%，n＝9）與98.8%（RSD＝1.19%，n＝9）。結論：本方法簡單、準確、、重復性好，可用于天花粉中天門冬氨酸與谷氨酸的含量測定。

柱前衍生；反相高效液相色譜法；天花粉；天門冬氨酸；谷氨酸；含量測定

天花粉為葫蘆科植物栝樓Trichosanthes kirilowii Maxim.或雙邊栝樓T.rosthornii Harms的干燥根，收載于2010年版《中國藥典》（一部）[1]，是一種富含氨基酸的中藥材[2]，其中所含的天門冬氨酸與谷氨酸在人體的氨基酸蛋白質代謝中有較重要的作用[3]。因此，測定天花粉中天門冬氨酸與谷氨酸的含量對評價其質量有一定的意義。目前尚無對天花粉中天門冬氨酸與谷氨酸含量進行同時測定的報道，故筆者采用柱前衍生反相高效液相色譜（RP-HPLC）法對其進行了測定。

1 儀器與試藥

2695型HPLC儀，含2487紫外檢測器、Empower色譜工作站（美國Waters公司）；Cary100型紫外-可見分光光度計（美國Varian公司）；KQ5200DB型超聲波提取器（昆山市超聲儀器有限公司，功率：200W，工作頻率：40kHz）。

天門冬氨酸、谷氨酸標準品（天津天安藥業(yè)股份有限公司，批號分別為2009111911、2009112907，含量均≥99.5%）；異硫氰酸苯酯（北京北分瑞利分析儀器（集團）有限責任公司，批號：AAD06001）；乙腈（上海陸都化學試劑廠，色譜純）；其余試劑均為分析純；天花粉（樂山康發(fā)藥業(yè)股份有限公司，批號：1000302、1000509、1000706）。

2 方法與結果

2.1 混合標準品溶液的制備

精密稱取天門冬氨酸標準品243.2mg、谷氨酸標準品421.6mg，分置2個200mL量瓶中，加鹽酸溶液（0.1mol·L－1）溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為標準品貯備液；精密量取上述貯備液各10mL，置同一100mL量瓶中，加鹽酸溶液（0.1mol·L－1）稀釋至刻度，搖勻，作為混合標準品溶液。

2.2 供試品溶液的制備

取天花粉（批號：1000302）適量，粉碎后混勻，精密稱取3.0618g，置具塞錐形瓶中，分別加80%的甲醇溶液100、100、50、50mL提取4次，每次60℃超聲振搖20min，合并甲醇液，水浴蒸干，殘渣用鹽酸溶液（0.1mol·L－1）溶解并轉移至50mL量瓶中，再用鹽酸溶液（0.1mol·L－1）稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 樣品衍生化

精密量取供試品溶液適量（10～400μL），置1mL量瓶中，加異硫氰酸苯酯-乙腈溶液（1∶80，V/V）200μL，再加三乙胺-乙腈溶液（1.4∶8.6，V/V）稀釋至刻度，搖勻，放置1h，轉移至試管中，加正己烷1mL，振搖，分取下層液體，濾過，取續(xù)濾液作為被測溶液。

2.4 檢測波長的選擇

取混合標準品溶液100μL，按“2.3”項下方法衍生后，取續(xù)濾液于200～400nm波長范圍內掃描，發(fā)現(xiàn)溶液中2種成分均在248nm波長處有最大吸收，故選擇248nm作為檢測波長。

2.5 色譜條件

色譜柱：Venusil-AA氨基酸分析柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相A：0.05mol·L－1醋酸鈉溶液（pH 6.5），流動相B：乙腈-水（80∶20，V/V），梯度洗脫（洗脫梯度見表1）；流速：1.0mL·min－1；檢測波長：248nm；柱溫：25℃；進樣量：10μL。

表1 洗脫梯度Tab 1 Gradient elution

2.6 系統(tǒng)適用性試驗

分別取供試品溶液100μL和混合標準品溶液100μL，按“2.3”項下方法衍生后取續(xù)濾液，照“2.5”項下色譜條件分別進樣測定。結果，供試品色譜中，有與混合標準品色譜中天門冬氨酸和谷氨酸峰相對應的色譜峰，且2個峰與其他色譜峰均有較好的分離度（＞1.5），理論板數(shù)均＞3000。另取鹽酸溶液（0.1mol·L－1）100μL，按“2.3”項下方法衍生后濾過，作為空白對照溶液，照“2.5”項下色譜條件進樣，結果空白對照對樣品測定無干擾。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.混合標準品；B.供試品；C.空白對照；1.天門冬氨酸；2.谷氨酸Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed standard；B.test sample；C.blank control；1.aspartic acid；2.glutamic acid

2.7 線性關系考察

精密量取混合標準品溶液10、100、200、300、400μL，分別置于1mL量瓶中，按“2.3”項下方法衍生后取續(xù)濾液，照“2.5”項下色譜條件進樣測定。以氨基酸進樣量（c）對峰面積積分值（A）進行線性回歸，得天門冬氨酸與谷氨酸的回歸方程分別為A＝68224c－113.7（r＝0.9996，n＝5）、A＝62360c－88.5（r＝0.9997，n＝5）。結果表明，天門冬氨酸與谷氨酸的進樣量分別在12.16～486.40、21.08～843.20ng范圍內與各自峰面積積分值呈良好的線性關系。

2.8 精密度試驗

精密量取混合標準品溶液100μL，按“2.3”項下方法衍生后取續(xù)濾液，照“2.5”項下色譜條件連續(xù)進樣5次。結果，天門冬氨酸的平均峰面積為829600，RSD＝1.6%（n＝5）；谷氨酸的平均峰面積為1314547，RSD＝1.4%（n＝5），表明儀器精密度良好。

2.9 重復性試驗

精密量取供試品溶液100μL，共6份，分別置于1mL量瓶中，按“2.3”項下方法衍生后取續(xù)濾液，照“2.5”項下色譜條件進樣測定。結果，天門冬氨酸的平均含量為0.04‰，RSD＝1.8%（n＝6）；谷氨酸的平均含量為0.11‰，RSD＝1.5%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.10 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液100μL，按“2.3”項下方法衍生后取續(xù)濾液，照“2.5”項下色譜條件分別于0、2、6、12h進樣測定峰面積。結果，天門冬氨酸與谷氨酸峰面積的RSD分別為1.8%與1.5%（n＝4），表明供試品溶液在室溫條件下12h內穩(wěn)定。

2.11 加樣回收率試驗

取天花粉（批號：1000302）適量，粉碎后混勻，精密稱取細粉9份，分別置于具塞錐形瓶中，分別精密加入天門冬氨酸標準品貯備液60、60、60、70、70、70、80、80、80μL和谷氨酸標準品貯備液90、90、90、110、110、110、130、130、130μL，照“2.2”項下方法制備供試品溶液，濾過，取續(xù)濾液100μL，按“2.3”項下方法衍生后取續(xù)濾液，照“2.5”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 2Results of recovery tests（n＝9）

2.12 樣品含量測定

取天花粉適量，粉碎后混勻，精密稱取粉末約3g，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，精密量取100μL，置1mL量瓶中，按“2.3”項下方法衍生后取續(xù)濾液，照“2.5”項下色譜條件進樣測定，代入回歸方程計算樣品含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果Tab 3 Content determination of samples

3 討論

在試驗中加入正己烷的目的是除去中藥材提取和衍生化反應后被測溶液中的脂溶性物質。本方法簡單、準確、重復性

好，可用于天花粉中天門冬氨酸與谷氨酸的含量測定。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：52.

[2] 徐國均.生藥學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1987：409.

[3] 陳瓊華.生物化學[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1991：283.

Content Determination of Aspartic Acid and Glutamic Acid in Trichosanthis Radix by Pre-column Derivatization RP-HPLC

PAN Jian，LIU Wen，CHEN Wen-qiu，YU Min-ling（Leshan Institute for Food and Drug Control，Sichuan Leshan 614000，China）

OBJECTIVE：To establish the method for the content determination of aspartic acid and glutamic acid in Trichosanthis Radix.METHODS：Pre-column derivatization RP-HPLC method was adopted.In alkaline conditions，amino acids reacted with phenyl isothiocyanate to obtain the derivatives of benzene isothiocyanate-amino acid complex.The Venusil-AA amino acid analysis（250mm×4.6mm，5μm）column was used and the detection wavelength was set at 248nm.The mobile phase A was 0.05mol·L－1sodium acetate solution（pH6.5）and the mobile phase B consisted of acetonitrile-water（80∶20，V/V）（gradient elution）.RESULTS：The linear range of aspartic acid was 12.16～486.40ng（r＝0.9996）and that of glutamic acid was 21.08～843.20ng（r＝0.9997）；average recoveries were 98.5%（RSD＝1.43%，n＝9）and 98.8%（RSD＝1.19%，n＝9）.CONCLUSION：This method is simple，accurate and reproducible for the content determination of aspartic acid and glutamic acid in Trichosanthis Radix.

Pre-column derivatization；RP-HPLC；Trichosanthis Radix；Aspartic acid；Glutamic acid；Content determination

R284.1；R927.2

A

1001-0408（2012）35-3326-03

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2012.35.22

＊主管藥師。研究方向：藥物分析。電話：0833-2131877。E-mail：panjian38@163.com

#通訊作者：副主任藥師。研究方向：藥物分析。電話：0833-2131876。E-mail：89729204@qq.com

2011-09-07

2011-12-15）