六味參苓顆粒的質量標準研究

雷 寧，王 玲，孫健姿，吳 誠，劉麗宏

（解放軍第二炮兵總醫(yī)院藥學部，北京100088）

六味參苓顆粒的質量標準研究

雷 寧＊，王 玲，孫健姿，吳 誠，劉麗宏#

（解放軍第二炮兵總醫(yī)院藥學部，北京100088）

目的：建立六味參苓顆粒的質量控制方法。方法：采用薄層色譜（TLC）法對處方中西洋參、黃芪、麥冬、茯苓、枳殼進行定性鑒別；采用高效液相色譜法測定西洋參中人參皂苷Rb1的含量。結果：TLC專屬性強，陰性對照無干擾；人參皂苷Rb1的濃度在26.4～792.0μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關系（r＝0.999 7），方法平均回收率為98.35%，RSD＝2.09%（n＝6）。結論：所建方法簡便、可行，可用于六味參苓顆粒的質量控制。

六味參苓顆粒；薄層色譜法；高效液相色譜法；人參皂苷Rb1

六味參苓顆粒是以臨床經(jīng)驗方為基礎，經(jīng)過現(xiàn)代制備工藝制成的中藥復方制劑，由西洋參、黃芪、麥冬、茯苓、五味子、枳殼6味中藥組成。臨床用于治療勞力過度、損傷心脾、耗傷氣陰所致的脫力勞傷，癥見倦怠乏力、肢體酸痛、足跟發(fā)軟、手腳顫抖、頭暈、困倦、煩躁不安、胸悶心悸、口干多汗，以及運動性疲勞見上述證候者。為有效控制其質量，確保臨床用藥安全、有效，筆者對處方中西洋參、黃芪、麥冬、茯苓、枳殼5味藥材用薄層色譜（TLC）法進行定性鑒別，并用高效液相色譜（HPLC）法對西洋參中的藥效成分人參皂苷Rb1進行了定量分析。以此建立的方法簡便可行、重復性好，可用于六味參苓顆粒的質量控制。

1 儀器與試藥

LC-20A HPLC儀，包括DGU-20A3脫氣機、LC-20AT溶劑輸送泵、SIL-20A自動進樣器、CTO-20A柱溫箱、SPD-20A紫外-可見檢測器、LCSolution色譜工作站（日本島津公司）；RE-52AA旋轉蒸發(fā)器、SHZ-Ⅲ循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；KQ-500V超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司，功率：500 W，頻率：40 kHz）；HWS28電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）。

六味參苓顆粒（批號：20090310、20090317、20090324，規(guī)格：4.5 g/袋）及相應陰性樣品均由我院藥學部制劑室自制；人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、人參皂苷Rg1、黃芪甲苷對照品和麥冬、茯苓、枳殼對照藥材（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為 110704-200318、0754-9913、0703-200117、110781-200613、120955-200406、121117-100605、0981-200202）；甲醇、乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；蒸餾水為我院自制雙重蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 定性鑒別

2.1 西洋參的TLC鑒別

取本品10 g，研細，加甲醇30 mL，超聲處理30 min，放冷，濾過，收集濾液，蒸干，殘渣加水25 mL使溶解，用乙醚振搖提取2次，每次10 mL，棄去乙醚液，水層用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次15 mL。合并正丁醇提取液，用水洗滌2次，每次20 mL，分取正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液；取缺西洋參的陰性樣品適量，同法制成陰性對照溶液；另取人參皂苷Rb1、Re、Rg1對照品適量，加甲醇制成每1 mL各含0.5 mg上述對照品的混合溶液，作為對照品溶液。照TL法[1]試驗，吸取上述3種溶液各μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2 V/V/V）在10℃放置分層的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視結果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同的紫紅色斑點；陰性對照無干擾。西洋參的TLC見圖1。C5， 。

圖1 西洋參的TLC1.人參皂苷 Rb1、Re、Rg1混合對照品；2、3.供試品；4.陰性對照Fig 1 TLC of Panax quinguefolium1.mixed control of rinsenoside Rb1，Re，Rg1；2，3.test samples；4.negativecontrol

2.2 黃芪的TLC鑒別

取本品8 g，研細，加水飽和正丁醇80 mL，加熱回流1 h，濾過，濾液用氨試液洗滌2次，每次40 mL，合并正丁醇液，再用水洗滌2次，每次40 mL，棄去水液，將正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液；取缺黃芪的陰性樣品，同法制成陰性對照溶液；另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。照TLC法[1]試驗，吸取上述3種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2，V/V/V）在10℃放置分層的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；陰性對照無干擾。黃芪的TLC見圖2。

圖2 黃芪的TLC1、2.供試品；3.黃芪甲苷對照品；4、5.陰性對照Fig 2 TLC of Astragali Radix1，2.test samples；3.astragaloside Ⅳ control；4，5.negative controls

2.3 麥冬的TLC鑒別

取本品10 g，研細，加水飽和的正丁醇30 mL，超聲提取30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加水10 mL使溶解，加鹽酸2 mL，加熱回流1 h，放冷，用三氯甲烷振搖提取3次，每次20 mL，合并三氯甲烷層，水浴蒸干溶劑，殘渣加1 mL三氯甲烷使溶解，作為供試品溶液；取缺麥冬的陰性樣品，同法制成陰性對照溶液；另取麥冬對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。照TLC法[1]試驗，吸取上述3種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（2∶1，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，于105℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；陰性對照無干擾。麥冬的TLC見圖3。

圖3 麥冬的TLC1.缺麥冬陰性對照；2、3.供試品；4.麥冬對照藥材Fig 3 TLC of Ophiopogon japonicus1.negative control without Radix Ophiopogonis；2，3.test sample；4.Ophiopogonis Radix reference substance

2.4 茯苓的TLC鑒別

取本品15 g，研細，加石油醚150 mL，超聲處理30 min，濾過，藥渣備用，濾液棄去，藥渣揮干溶劑，加乙醚150 mL，超聲處理10 min，濾過，藥渣備用，濾液蒸干，殘渣加乙酸乙酯2 mL溶解，作為供試品溶液；取缺茯苓的陰性樣品適量，同法制成陰性對照溶液；另取茯苓對照藥材1.0 g，加甲醇20 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液回收溶劑至干，殘渣加甲醇約1 mL溶解，作為對照藥材溶液。照TLC法[1]試驗，吸取上述3種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G板上，以石油醚-丙酮-乙酸乙酯（84∶15∶1，V/V/V）飽和15 min后的溶液為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；陰性對照無干擾。茯苓的TLC見圖4。

圖4 茯苓的TLC1.茯苓對照藥材；2、3.供試品；4.陰性對照Fig 4 TLC of Poria cocos1.Poria reference substance；2，3.test samples；4.negative control

2.5 枳殼的TLC鑒別

取本品10 g，研細，加甲醇30 mL，超聲提取30 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液；取缺枳殼的陰性樣品，同法制成陰性對照溶液；另取枳殼對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。照TLC法[1]試驗，吸取上述3種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水（100∶17∶13，V/V/V）的溶液為展開劑，展開，取出，晾干，紫外光（365 nm）燈下檢視。結果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；陰性對照無干擾。枳殼的TLC見圖5。

3 人參皂苷Rb1的含量測定

圖5 枳殼的TLC1.供試品；2.枳殼對照藥材；3.陰性對照Fig 5 TLC of Crtras aurantium1.test sample；2.Aurantii Fructus reference substance；3.negativecontrol

3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Shimpack ODSC18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-水，梯度洗脫（0～20 min，25%～35%乙腈；20～30 min，35%～40%乙腈；30～35 min，40%乙腈）；流速：1.0 mL·min－1；檢測波長：203 nm；柱溫：35℃；進樣量：10μL。在此色譜條件下，吸取供試品、對照品、陰性對照溶液適量，進樣測定。結果，供試品中人參皂苷Rb1與其他組分峰能達到基線分離；陰性對照無干擾。理論板數(shù)按人參皂苷Rb1峰算應不低于2 500。色譜見圖6。

3.2 溶液的制備

3.2.1 對照品溶液 精密稱取人參皂苷Rb1對照品適量，加甲醇制成每1 mL含5.28 mg的對照品貯備液。

3.2.2 供試品溶液 將適量本品研細，取約10 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取濾液10 mL，置蒸發(fā)皿中，蒸干，殘渣加水15 mL使溶解，用乙醚振搖提取2次，每次10 mL，棄去乙醚液，水層用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次10 mL。合并正丁醇提取液，用水洗滌2次，每次10 mL，分取正丁醇液，置蒸發(fā)皿中，蒸干，殘渣加50%甲醇適量使溶解，并轉移至25 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

圖6 高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.人參皂苷Rb1Fig 6 HPLCchromatogramsA.substance control；B.test sample；C.negative control；1.rinsenoside Rb1

3.2.3 陰性對照溶液 取缺西洋參的陰性樣品適量，按“3.2.2”項下方法制成陰性對照溶液。

3.3 線性關系考察

分別精密吸取人參皂苷Rb1對照品貯備液0.05、0.10、0.20、0.50、0.80、1.00、1.20、1.50 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配制成不同濃度的對照品溶液，依次注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定。以峰面積積分值（Y）為縱坐標，人參皂苷Rb1檢測濃度（X）為橫坐標，進行線性回歸，得回歸方程為Y＝2 486X+15 753（r＝0.999 7，n＝6）。結果表明，人參皂苷Rb1檢測濃度在26.4～792.0μg·mL－1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關系。

3.4 精密度試驗

精密吸取濃度為0.528 mg·mL－1的人參皂苷Rb1對照品溶液10μL，注入液相色譜儀，在上述色譜條件下重復測定6次。結果，RSD＝1.57%（n＝6），表明儀器精密度良好。

3.5 加樣回收率試驗

稱取已知人參皂苷Rb1含量的同一批號供試品（批號：20090324，含量：5.01 mg·g－1）約2.5 g，平行6份，精密稱定，分別精密加入人參皂苷Rb1對照品溶液適量，按“3.2.2”項下方法處理，照上述色譜條件測定，計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

3.6 樣品含量測定

分別取3批樣品適量，按“3.2.2”項下方法制備供試品溶液，用0.45μm微孔濾膜濾過，照上述色譜條件測定，以外標法計算人參皂苷Rb1的含量。結果，3批六味參苓顆粒（批號：20090310、20090317、20090324，規(guī)格：4.5 g/袋）中人參皂苷Rb1的含量分別為4.99、5.06、5.01 mg·g－1，平均含量為5.02 mg·g－1。

4 討論

4.1 流動相的選擇

制劑處方中的君藥西洋參是名貴中藥材，人參皂苷為其主要活性成分之一，常被用作西洋參制劑的定量標準成分。本文在考察流動相時，曾根據(jù)文獻研究了甲醇-水[2]、乙腈-0.4%磷酸[3]等梯度洗脫的效果，結果均不能將人參皂苷Rb1的色譜峰與其他峰完全分離，且峰形不佳。最后選擇乙腈-水梯度洗脫體系，結果能使樣品中人參皂苷Rb1的色譜峰得到良好分離。

4.2 流動相梯度的優(yōu)化

含量測定的難點主要在于將西洋參中人參皂苷Rb1與制劑中其他皂苷類成分完全分離。筆者在參考2010年版《中國藥典》中西洋參含量測定方法以及文獻[4，5]方法的基礎上，對流動相的梯度進行了優(yōu)化，從而實現(xiàn)了人參皂苷Rb1與麥冬、黃芪等藥材中皂苷類成分的基線分離。

4.3 供試品溶液的制備方法

西洋參制劑組方有簡有繁，成分復雜多樣，六味參苓顆粒組方中西洋參、黃芪、麥冬藥材均含有皂苷和多糖類成分。在供試品溶液的制備過程中，筆者先后考察了甲醇超聲提取、甲醇回流提取再大孔樹脂吸附等方法。結果均不理想，最后采取先用乙醚脫脂，后用正丁醇萃取富集皂苷，再用水洗滌正丁醇層去除糖類雜質的方法，在TLC鑒別和含量測定中均能較好運用。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄34.

[2] 黃海欣.ELSD-HPLC法測定生脈飲中人參皂苷Re、Rg1和Rb1的含量[J].中國藥師，2010，13（7）：1 045.

[3] 鄒文光，黃 晨.HPLC測定血塞通膠囊中四種皂苷含量的研究[J].中國現(xiàn)代藥物應用，2010，4（10）：99.

[4] 馮 旭，鄧家剛，李 松.復方黃根顆粒的質量標準研究[J].中國藥房，2011，22（15）：1 402.

[5] 楊 軍，馬 靜，李學林.不同廠家參脈注射液特征指紋圖譜的比較[J].中國藥房，2011，22（7）：633.

Study on Quality Standard of Liuwei Shenling Granules

LEI Ning，WANG Ling，SUN Jian-zi，WU Cheng，LIU Li-hong
（Dept.of Pharmacy，Second Artillery Forces General Hospital of PLA，Beijing 100088，China）

OBJECTIVE：To establish the quality control of Liuwei shenling granules.METHODS：Panax quinquefolium，Astragali Radix，Ophiopogon japonicus，Poria cocos and Citrus aurantium were identified by TLC.The content of ginsenoside Rb1in Panacis Quinquefolii Radix was determined by HPLC.RESULTS：The TLC identification method exhibited good specificities without interference form negative samples.The linear range of ginsenoside Rb1 was 26.4～792.0μg·mL－1（r＝0.999 7）and the average recovery was 98.35%（RSD＝2.09%，n＝6）.CONCLUSION：The established standard is simple，feasible and suitable for the quality control of Liuwei shenling granules.

Liuwei shenling granules；TLC；HPLC；Ginsenoside Rb1

R284.2；R283.627

A

1001-0408（2012）35-3328-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2012.35.23

2011-09-07

2011-11-20）