正交試驗(yàn)優(yōu)選水飛薊果仁磷脂提取工藝

杜向萍，陳鈞，張春曉，郭丹釗，2，楊學(xué)娟，劉友彬（.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江2203；2.河南科技學(xué)院生科院，河南新鄉(xiāng) 453003）

正交試驗(yàn)優(yōu)選水飛薊果仁磷脂提取工藝

杜向萍1＊，陳鈞1#，張春曉1，郭丹釗1，2，楊學(xué)娟1，劉友彬1（1.江蘇大學(xué)藥學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江212013；2.河南科技學(xué)院生科院，河南新鄉(xiāng) 453003）

目的：優(yōu)化水飛薊果仁中磷脂的提取工藝。方法：在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取正庚烷-乙醇比例、固液比、提取時(shí)間、提取溫度為考察因素，以水飛薊果仁中磷脂得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)選工藝。結(jié)果：最佳提取工藝為正庚烷-乙醇（3∶1，V/V），提取溫度80℃，固液比1∶9（m/V），提取時(shí)間120min，在此條件下水飛薊果仁中磷脂得率為0.3402%。結(jié)論：所選工藝合理、可行，可為水飛薊藥材資源的綜合開發(fā)與應(yīng)用提供依據(jù)。

水飛薊果仁；磷脂；回流提??；鉬藍(lán)比色法

水飛薊（Sliybum maruianum L.Gaertn.）又名水飛雉、乳雉子，是菊科水飛薊屬植物，原產(chǎn)于地中海沿岸[1]，是歐洲民間的一種草藥。它的藥用有效成分水飛薊賓存在于其廋果水飛薊籽的果皮中，果仁含油脂25%[2]。磷脂是生物膜的重要組成部分，具有重要的生物學(xué)活性，如健腦、抗疲勞、降血脂[3～6]等。植物磷脂與蛋白質(zhì)、糖類、脂肪酸等物質(zhì)以結(jié)合狀態(tài)存在，是一類重要的油脂伴隨物[7]。目前，關(guān)于水飛薊果仁中磷脂的相關(guān)研究未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)旨在通過單因素和正交試驗(yàn)確定水飛薊果仁中磷脂的最佳提取工藝，為水飛薊籽的綜合利用提供研究基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

SARTORIUS AG電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；BuchiR-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司）；KQ-600DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；H-S數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠）；UV-2500紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；DHG-9076A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）。

水飛薊籽藥材，購于江蘇中興藥業(yè)有限公司，經(jīng)江蘇大學(xué)藥學(xué)院陳鈞教授鑒定為菊科植物水飛薊的果實(shí)，經(jīng)脫殼機(jī)進(jìn)行殼仁分離后，收集水飛薊果仁于干燥箱中，60℃干燥，粉碎過篩，置干燥器中，備用。硝酸、高氯酸均為優(yōu)級(jí)純，正庚烷、正己烷、異丙醇、無水乙醇、無水硫酸鈉、抗壞血酸、鉬酸銨、磷酸二氫鉀、98%濃硫酸等均為分析純。顯色液：3mol·L－1硫酸-水-2.5%鉬酸銨-10%抗壞血酸（1∶5∶1∶1，V/V/V/V），配制時(shí)按順序、比例加入，當(dāng)天配制當(dāng)天使用[8]。

2 方法與結(jié)果

2.1 總磷脂的含量測(cè)定

2.1.1 磷標(biāo)準(zhǔn)液的制備 精密稱取105℃干燥至恒重的磷酸二氫鉀0.4392g，用蒸餾水溶解并定容至100mL，為磷貯備液；精密吸取貯備液1mL，置于100mL量瓶中，用蒸餾水定容，作為磷標(biāo)準(zhǔn)液，此液含磷10.01μg·mL－1。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取水飛薊果仁粉末10g，加正庚烷-乙醇（HPE，1∶1，V/V）50mL，70℃水浴回流提取1h，濾過，濾渣用20mL HPE（1∶1，V/V）混合溶劑沖洗，合并濾液，加入1/4總量的1%Na2SO4，混勻，分液漏斗中靜置后樣品分為2相，下相用混合溶劑重復(fù)萃取2次，合并上相，經(jīng)無水Na2SO4干燥后濾過，濾液于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、濃縮，濃縮液定容至25mL[9]。

2.1.3 總磷脂含量的測(cè)定方法 采用紫外-可見分光光度法，通過鉬藍(lán)比色法測(cè)定總磷脂含量。精密吸取供試品溶液0.5mL，置于錐形瓶中，水浴上揮干溶劑，另取一只錐形瓶為空白，分別加入一定量的消化液（高氯酸∶硝酸＝1∶4，V/V）[9]。先在電爐上小火加熱消化約30min，待黃煙冒盡后，升高溫度加熱至大量白煙冒盡并有白色固體析出，停止消化。消化完全后，分別用顯色液定容至5mL，65℃水浴恒溫10min，冷卻后以空白調(diào)零，于指定波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)回歸方程計(jì)算供試品中磷的含量，將所得結(jié)果乘以磷脂轉(zhuǎn)換系數(shù)25，即得總磷脂含量[10]。

2.1.4 最大吸收波長(zhǎng)的確定 精密吸取供試品溶液0.5mL，置于錐形瓶中，水浴上揮干溶劑，另取錐形瓶2只，一只加入磷標(biāo)準(zhǔn)液0.2mL，一只作為空白管，各管分別加入一定量消化液，按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作，在500～900nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定磷標(biāo)準(zhǔn)液和供試品溶液的吸光度，確定最大吸收波長(zhǎng)。結(jié)果，二者均在830nm波長(zhǎng)處有最大吸收，吸收光譜基本一致。Abraham SA等[11]指出該波長(zhǎng)在820nm處，本文結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致，故確定最大檢測(cè)波長(zhǎng)為830nm。紫外吸收光譜見圖1。

圖1 紫外吸收光譜Fig 1 UV absorption spectrum

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取磷標(biāo)準(zhǔn)液0、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mL，分別置潔凈干燥的錐形瓶中，各加入一定量的消化液，與供試品同步進(jìn)行。按“2.1.3”項(xiàng)下方法操作，于830nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度（y）為縱坐標(biāo)，磷檢測(cè)濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y＝0.239x+0.0026（r＝0.9998）。結(jié)果表明，磷的檢測(cè)濃度在0.2002～0.6006μg·mL－1范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.2 提取工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn) 在其他條件都相同的情況下，分別依次考察提取溶劑種類（HPE、正庚烷-異丙醇（HPIP）、正己烷-乙醇（HXE）、正己烷-異丙醇（HXIP））、各組混合溶劑的配比（6∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3，均為V/V）、提取時(shí)間（60、90、120、150、180min）、固液比（1∶3、1∶5、1∶7、1∶9、1∶11，均為m/V）、提取溫度（60、70、80、90、100℃）等對(duì)磷脂得率（得率＝磷脂質(zhì)量/藥材質(zhì)量×100%）的影響。結(jié)果表明，當(dāng)提取溶劑為HPE，溶劑配比為3∶1，提取時(shí)間為120min，固液比為1∶7，提取溫度為90℃時(shí)，水飛薊果仁磷脂得率最佳。

2.2.2 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，精確稱取10g水飛薊果仁粉末數(shù)份，以HPE為提取溶劑，選擇HPE比例（A，V/V）、固液比（B，m/V）、提取時(shí)間（C）、提取溫度（D）為考察因素，按L9（34）正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，以水飛薊果仁磷脂得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)優(yōu)選工藝。因素水平見表1；正交試驗(yàn)結(jié)果見表2；方差分析結(jié)果見表3。

表1 因素水平Tab 1 Factors and levels

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab 2Results of orthogonal test

由表2、表3可知，各因素對(duì)磷脂得率的影響主次順序?yàn)锳＞D＞B＞C，即HPE比例＞提取溫度＞固液比＞提取時(shí)間，其中，HPE比例、提取溫度對(duì)磷脂得率有顯著性影響（P＜0.05）。最佳工藝為A3B2C2D3，即HPE比例3∶1（V/V），提取溫度80℃，固液比1∶9，提取時(shí)間120min。

2.3 提取次數(shù)對(duì)水飛薊果仁磷脂得率的影響

筆者在上述優(yōu)化工藝條件下，考察了不同提取次數(shù)對(duì)水飛薊果仁磷脂得率的影響。結(jié)果，提取1次的磷脂得率為0.3402%，提取2次的磷脂得率為0.3508%，提取3次的磷脂得率為0.3545%，表明隨著提取次數(shù)的增加，磷脂得率呈上升趨勢(shì)，但增量不明顯?？紤]到減少操作環(huán)節(jié)和節(jié)約成本等因素，提取次數(shù)選為1次較適宜。

2.4 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

取水飛薊果仁粉末適量，在最佳提取工藝下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。結(jié)果，磷脂得率分別為0.3369%、0.3427%、0.3408%，其平均值為0.3402%，與正交試驗(yàn)結(jié)果最高值相當(dāng)，表明所選工藝合理、可行。

表3 方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis

3 討論

磷脂是細(xì)胞膜的組成成分，與蛋白和多糖形成復(fù)合物，較難提取。由Folch（1957）創(chuàng)建的氯仿-甲醇混合溶劑提取法至今仍是較流行的脂質(zhì)提取方法，但氯仿、甲醇是高毒性和高刺激性的有機(jī)溶劑，故本文另選用安全性較高的烷烴-醇-水體系進(jìn)行提取。

[1] 徐德峰，張衛(wèi)明，史勁松，等.國(guó)內(nèi)水飛薊資源利用現(xiàn)狀與展望[J].食品研究與開發(fā)，2007，28（2）：157.

[2] 陳毓荃，王春梅，張 文.水飛薊綜合利用基礎(chǔ)研究Ⅱ果實(shí)油脂和蛋白質(zhì)[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1998，7（1）：79.

[3] 王 芳，余恩欣，吳東方.銀杏葉提取物磷脂酰膽堿復(fù)合物對(duì)缺血大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的影響[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2004，39（2）：114.

[4] 劉淑娟.不同磷脂對(duì)小鼠耐力影響的比較研究[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006，37（2）：208.

[5] 何新霞，胡燕月，金曉玲.大豆磷脂對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性高脂血癥的預(yù)防[J].浙江師大學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2001，24（2）：191.

[6] 石富成，周景春，佟 銘，等.大豆磷脂治療高脂血癥的有效劑量及其主要成分[J].中國(guó)生化藥物雜志，1998，19（3）：150.

[7] 曹 棟，裘愛泳，王興國(guó).磷脂結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、功能及研究現(xiàn)狀[J].糧食與油脂，2004，5：3.

[8] 王立新，吳啟南，吳德康.鉬藍(lán)比色法測(cè)定不同產(chǎn)地合子草中總磷脂的含量[J].中國(guó)野生植物資源，2001，20（3）：50.

[9] 王維亞.烏骨雞磷脂的提取、成分分析及活性研究[D].南昌：南昌大學(xué)，2007.

[10] 上海市醫(yī)學(xué)化驗(yàn)所.臨床生化檢驗(yàn)（上冊(cè)）[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979：185-187.

[11] Abraham SA，Edwards K，Karlsson G，et al.An evaluation of transmembrane ion gradient-mediated encapsulation of topotecan within liposomes[J].J Control Release，2004，96（3）：449.

Optimization of Extraction Technology of Phospholipids from the Kernel of Sliybum maruianum

DU Xiang-ping，CHEN Jun，ZHANG Chun-xiao，GUO Dan-zhao，YANG Xue-juan，LIU You-bin（College of Pharmacy，Jiangsu University，Jiangsu Zhenjiang 212013，China）
GUO Dan-zhao（College of Life Science and Technology，Henan Institute of Science and Technology，Henan Xinxiang 453003，China）

OBJECTIVE：To optimize the extraction technology of phospholipids from the kernel of Sliybum maruianum.METHODS：Based on single factor test，the extraction technology was optimized by orthogonal test with ratio of heptane to ethanol，the ratio of solid to liquid，extraction time，extraction temperature as factors using the yield of phospholipids as index.RESULTS：The optimal extraction condition was as follows：the ratio of heptane to ethanol of 3∶1（V/V）extraction temperature of 80℃，the ratio of solid to liquid of 1∶9（m/V），extraction time of 120min.The yield of phospholipids was 0.3402%under the optimal extraction condition.CONCLUSION：The optimal technology is reasonable and feasible，and it can provide theoretical base for the further development of S.maruianum.

Kernel of Sliybum maruianum；Phospholipids；Reflux extraction；Molybdenum blue method

R284.2；R283.2

A

1001-0408（2012）35-3305-03

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2012.35.14

2011-09-23

2011-11-26）