LC-MS法同時測定骨康膠囊中6種主要成分的含量

楊潔芳（重慶市第九人民醫(yī)院藥劑科，重慶 400700）

LC-MS法同時測定骨康膠囊中6種主要成分的含量

楊潔芳＊（重慶市第九人民醫(yī)院藥劑科，重慶 400700）

目的：建立同時測定骨康膠囊中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、補骨脂素和異補骨脂素含量的方法，為骨康膠囊質(zhì)量評價提供依據(jù)。方法：采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)。色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18（150mm×4.6mm，5μm），流動相為甲醇-水（梯度洗脫），分析時間為30min。采用電噴霧離子源正離子模式，通過選擇離子監(jiān)測（SRM）模式同時監(jiān)測復(fù)方中6種成分及內(nèi)標(biāo)。結(jié)果：6種成分線性回歸方程的r值均≥0.9960，平均加樣回收率范圍為96.21%～101.82%，RSD范圍為2.23%～4.07%（n均為6）。骨康膠囊中6種主要成分，特別是川續(xù)斷皂苷Ⅵ在不同批次間含量很不均一。結(jié)論：本方法簡便、靈敏度高、專屬性好，適用于骨康膠囊的質(zhì)量評價；有必要制定嚴(yán)格的成分含量合格標(biāo)準(zhǔn)以便科學(xué)評價骨康膠囊的質(zhì)量。

骨康膠囊；液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)；三七皂苷R1；人參皂苷Rg1；人參皂苷Rb1；川續(xù)斷皂苷Ⅵ；補骨脂素；異補骨脂素；含量測定

骨康膠囊是由芭蕉根、炸醬草、補骨脂、續(xù)斷和三七組成的中藥復(fù)方制劑，具有滋補肝腎、強筋壯骨、通絡(luò)止痛的功效，用于治療骨折、股性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥屬肝腎不足、經(jīng)絡(luò)瘀阻者。為有效控制該產(chǎn)品質(zhì)量，保證臨床用藥安全、有效，本試驗擬采用液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）聯(lián)用技術(shù)同時測定骨康膠囊中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、補骨脂素和異補骨脂素6種主要成分的含量，以期為骨康膠囊的質(zhì)量控制提供一種選擇性強、靈敏、準(zhǔn)確的檢測方法。

1 儀器與試藥

2695高效液相色譜系統(tǒng)、Micromass ZQ2000MS檢測儀、Masslynx 4.1色譜工作站（美國Waters公司）；AE240電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；高速低溫離心機（美國Thermo公司）；KQ-3200E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，頻率：40kHz，功率：120W）。

骨康膠囊（貴州維康藥業(yè)有限公司，規(guī)格：4g/粒，批號：20110502、20100509、20100705）；三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、多潘立酮對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號 分 別 為 110745-200617、110703-200323、110704-200217、100304-2005027）；川續(xù)斷皂苷Ⅵ標(biāo)準(zhǔn)品（上海雅吉生物有限公司，批號：MUST-11121501，含量＞98%）；補骨脂素、異補骨脂素標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司，批號分別為091019、091104，含量均＞98%）；甲醇（色譜純，德國Merck公司）；甲酸（色譜純，上?；瘜W(xué)試劑有限公司）；超純水（美國Millipore公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

取本膠囊1粒，將內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至10mL玻璃管中，加入6mL甲醇，超聲提取30min，3500r·min－1離心10min，吸取上清液，以流動相稀釋至適當(dāng)倍數(shù)，12000r·min－1離心10min，所得上清液即為供試品溶液。

2.2 對照品貯備液的制備

精密稱取對照（標(biāo)準(zhǔn)）品三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、補骨脂素、異補骨脂素和多潘立酮（內(nèi)標(biāo)）分別為5.38、5.27、5.08、5.30、10.07、9.98、8.3mg，分別置于7個10mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻。將除多潘立酮外的其余6種對照（標(biāo)準(zhǔn)）品溶液各自稀釋若干倍后進(jìn)行混合，得到含三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、補骨脂素和異補骨脂素濃度依次為0.269、2.148、2.032、0.265、0.998、1.007μg·mL－1的混合對照品貯備液；將多潘立酮對照品溶液稀釋至適當(dāng)倍數(shù)得到終濃度為0.166μg·mL－1的內(nèi)標(biāo)貯備液。各貯備液置于4℃冰箱中保存，備用。

2.3 LC-MS分析條件

2.3.1 LC條件色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（150mm×4.6mm，5μm）；柱溫：（25±5）℃；流速：0.25mL·min－1；進(jìn)樣量：8μL；流動相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脫（0～16min，60%A；16～16.5min，60%→95%A；16.5～29min，95%A；29～30min，95%→60%A）；柱平衡時間：6min。

2.3.2 MS條件 采用電噴霧離子源正離子模式，選擇離子流監(jiān)測（SRM）模式采集數(shù)據(jù)；脫溶劑氣流量：400L·h－1；脫溶劑氣溫度：350℃；錐孔氣流量：35L·h－1；離子源溫度：120℃；毛細(xì)管電壓：3.2kV。6種對照品的主要MS參數(shù)信息見表1；SRM色譜圖見圖1。

表1 6種對照品和內(nèi)標(biāo)的主要MS參數(shù)信息Tab 1 Main mass parameters of 6chemical standards and internal standard

圖1 SRM色譜圖A.混合對照品；B.供試品（批號：20110502）；1.三七皂苷R1；2.人參皂苷Rb1；3.人參皂苷Rg1；4.川續(xù)斷皂苷Ⅵ；5.補骨脂素；6.異補骨脂素；IS.多潘立酮Fig 1 SRM chromatogramsA.mixed control；B.test sample（lot No.20110502）；1.notoginsenoside R1；2.ginsenoside Rb1；3.ginsenoside Rg1；4.asperosaponin Ⅵ；5.psoralen；6.isopsoralen；IS.domperidone.

由圖1可見，在上述LC-MS分析條件下，混合對照品溶液和供試品溶液中各成分的SRM圖譜色譜峰峰形良好，基本無雜質(zhì)峰干擾，表明該分析條件具有較好的分離度和靈敏度，可滿足對骨康膠囊中各成分定量的要求。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取混合對照品貯備液適量，以其作為混標(biāo)最高濃度溶液HB1，并用甲醇對其進(jìn)行倍比稀釋，依次獲得系列混標(biāo)溶液HB2～HB7。分別精密吸取系列混標(biāo)溶液各320μL，加入內(nèi)標(biāo)貯備液80μL，渦旋混勻后按上述LC-MS分析條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（y）為縱坐標(biāo)，對照品濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行一元線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，結(jié)果見表2。

表26 種對照品的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Tab 2Linear relationships of 6compounds

2.4.2 精密度試驗 取混標(biāo)溶液HB4適量，連續(xù)進(jìn)樣6次，計算各色譜峰相對峰面積（待測成分峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積）的RSD。結(jié)果，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、補骨脂素、異補骨脂素相對峰面積的RSD分別為2.4%、1.2%、1.2%、1.9%、3.5%、2.5%（n均為6），表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一批（批號：20110502）供試品溶液的1000倍稀釋液適量，分別于0、2、4、6、8、12h進(jìn)樣測定。結(jié)果，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、補骨脂素、異補骨脂素相對峰面積的RSD分別為2.1%、3.1%、2.9%、0.6%、4.7%、4.1%（n均為6），表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗 取同一批（批號：20110502）骨康膠囊適量，共6份，分別按“2.1”項下方法制備供試品溶液，取其1000倍稀釋液進(jìn)樣測定。結(jié)果，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、補骨脂素、異補骨脂素相對峰面積的RSD分別為1.4%、1.6%、2.1%、1.1%、2.7%、0.7%（n均為6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密量取同一批（批號：20110502）骨康膠囊提取液1000倍稀釋液（三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、補骨脂素、異補骨脂素的質(zhì)量濃度分別為0.1069、0.6392、0.4046、0.0414、0.1318、0.1339μg·mL－1）適量，共6份，按檢出量精密加入等體積的混標(biāo)溶液HB4，照“2.1”項下方法制備供試品溶液，依法測定，計算加樣回收率。結(jié)果，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、川續(xù)斷皂苷Ⅵ、補骨脂素、異補骨脂素的平均加樣回收率分別為99.37%、99.97%、101.44%、101.82%、101.30%、96.21%，RSD分別為2.72%、2.23%、2.53%、4.07%、3.71%、3.35%（n均為6）。

2.5 樣品含量測定

取3批骨康膠囊，分別按“2.1”項下方法制備供試品溶液，取其1000倍稀釋液進(jìn)行LC-MS分析，每批重復(fù)測定3次，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算6種成分的含量，并將其按稀釋倍數(shù)換算成每粒膠囊（4g）中的含量，結(jié)果見表3。

3 討論

本試驗中檢測成分的選擇依據(jù)2010年版《中國藥典》規(guī)定的復(fù)方中各種藥材的主要成分制定[1]。

LC-MS聯(lián)用技術(shù)結(jié)合了LC的高分離效能和MS的高選擇性、高靈敏度的特點，其SRM離子檢測模式可以在不需完全分離的情況下實現(xiàn)多個組分的同時測定，因而在復(fù)方制劑多成分含量測定中具有傳統(tǒng)LC-UV方法不可比擬的優(yōu)勢[2，3]。方法學(xué)考察結(jié)果表明，本方法線性關(guān)系、精密度、重復(fù)性、加樣回收率等均能滿足定量分析要求，可以準(zhǔn)確地同時測定骨康膠囊中6種主要成分的含量，評價骨康膠囊的質(zhì)量。

樣品含量測定結(jié)果表明，不同批次樣品間各主要成分的含量存在不同程度的差異，其中川續(xù)斷皂苷Ⅵ在批號為20100509和20100705的骨康膠囊中僅有微量存在，與批號為20110502樣品中的含量相差甚選。這表明不同批次骨康膠囊間存在明顯的質(zhì)量差異，可能會對其藥理作用的發(fā)揮產(chǎn)生一定的影響。因此，有必要制定嚴(yán)格的成分含量合格標(biāo)準(zhǔn)，以確保骨康膠囊的質(zhì)量和療效的可控性。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：11、174、309.

[2] 邵清松，胡潤淮.HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)在中藥指紋圖譜研究中的應(yīng)用[J].中國藥房，2007，18（12）：938.

[3] 秦 楓，于生蘭，高彥慧，等.HPLC-MS/MS法同時測定三七須根總皂苷中人參皂苷Rg1和Re的含量[J].中國藥房，2010，21（31）：2922.

Simultaneous Determination of 6Mail Components in Gukang Capsules by LC-MS

YANG Jie-fang（Dept.of Pharmacy，Chongqing Ninth People’s Hospital，Chongqing 400700，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of notoginsenoside R1，ginsenoside Rg1，ginsenoside Rb1，asperosaponinⅥ，psoralen and isopsoralen in Gukang capsules.METHODS：LC-MS method was adopted.The separation was performed on Agilent Zorbax SB-C18（150mm×4.6mm，5μm）column with mobile phase consisted of methanol-water（gradient elution）.The detection time was 30min.The quantitative analysis of 6components and internal standard was performed using mass spectrometry with electrospray ionization（ESI）interface in positive selective reaction monitoring（SRM）mode.RESULTS：The average recoveries of 6components were 96.21%～101.82%（r≥0.9960）.The variations of RSD ranged from 2.23%to 4.07%（n＝6）.The contents of 6components in Gukang capsules，especially Asperosaponin Ⅵ，varied largely.CONCLUSION：The method is simple，sensitive and specific，and it is suitable for the quality evaluation of Gukang capsules；it is necessary to formulate strict content standard for the scientific quality evaluation of Gukang capsules.

Gukang capsules；LC-MS；Notoginsenoside R1；Ginsenoside Rg1；Ginsenoside Rb1；Asperosaponin Ⅵ；Psoralen；Isopsoralen；Content determination

R283.65；R927.2

A

1001-0408（2012）35-3344-03

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2012.35.29

＊副主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。電話：023-68251325。E-mail：1605038137@qq.com

2012-02-06

2012-07-30）