HPLC法同時(shí)測(cè)定阿奇霉素滴眼液中阿奇霉素及苯扎氯銨的含量

張 琳，劉葵葵，王 伶

(山東省醫(yī)療器械研究所，山東省醫(yī)用高分子材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250100)

阿奇霉素是15元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，具有較廣的抗菌譜，體外試驗(yàn)證明阿奇霉素對(duì)臨床上多種常見(jiàn)致病菌有抗菌作用。2007年4月底，美國(guó)FDA批準(zhǔn)英斯皮雷制藥(Inspire Pharmaceuticals)公司的1%阿齊霉素滴眼液(商品名:AzaSite)上市，用于治療細(xì)菌性結(jié)膜炎。阿奇霉素滴眼液為非單劑量包裝的滴眼液，因此其中添加了苯扎氯銨作為防腐劑，為了保證防腐劑的安全性及抑菌效用，需要對(duì)其含量進(jìn)行控制。本文建立了一種有效的HPLC方法，可同時(shí)測(cè)定阿奇霉素及苯扎氯銨的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜儀(G1314A VWD檢測(cè)器，Agilent 1100液相色譜化學(xué)工作站，美國(guó)，Agilent公司)

1.2 試藥 阿奇霉素滴眼液，本單位制備(批號(hào):0901141、0901142、0901143);阿奇霉素，上?，F(xiàn)代制藥股份(071004);阿奇霉素對(duì)照品，中國(guó)藥品生物制品檢定所(130593－200901);苯扎氯銨對(duì)照品，北京京廣化工有限公司(20050603);甲醇、乙腈為色譜純，水為三次蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 以高效液相色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版二部附錄V D)進(jìn)行測(cè)定。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(色譜柱型號(hào):CAPCELL PAK C18MGⅡ，4.6 mm ×150 mm，5μm)，柱溫 30 ℃，以磷酸鹽緩沖液(取 0.05 mol·L－1磷酸氫二鉀溶液，用20%磷酸調(diào)節(jié)溶液的pH至8.2)－乙腈(58∶42)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng) 210 nm，流速:1.0 mL·min－1，進(jìn)樣體積為 20 μL［1，3］。

2.2 溶液制備

2.2.1 枸櫞酸鹽緩沖溶液的制備 精密稱取枸櫞酸鈉5.0 g及枸櫞酸5.0 g，加水1 000 mL使溶解，即得。

2.2.2 阿奇霉素對(duì)照品溶液的制備 精密稱取阿奇霉素對(duì)照品30.0 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，作為阿奇霉素對(duì)照品溶液。

2.2.3 苯扎氯銨對(duì)照品溶液的制備 精密稱取苯扎氯銨對(duì)照品18.0 mg，置100 mL量瓶中，加枸櫞酸鹽緩沖液溶解并稀釋至刻度，精密量取0.5 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為苯扎氯銨對(duì)照品溶液。

2.2.4 供試品溶液的制備 精密稱取供試品3.0 g，置10 mL量瓶中，精密稱定，加0.06 g的氯化鈉，振搖使氯化鈉溶解，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，3 000 r·min－1離心20 min，取上層澄清液作為供試品溶液。

2.2.5 空白基質(zhì)溶液的制備 精密稱取不含阿奇霉素及苯扎氯銨的空白基質(zhì)3.0 g，加入0.06 g氯化鈉，強(qiáng)力振搖2 min，再用甲醇稀釋至刻度，搖勻，3 000 r·min－1離心20 min，取上層澄清液作為空白基質(zhì)溶液。

3 方法驗(yàn)證［2］

3.1 專屬性試驗(yàn) 精密量取甲醇、枸櫞酸鹽緩沖液、空白基質(zhì)溶液及上述各溶液20 μL注入色譜儀，記錄色譜圖。試驗(yàn)結(jié)果表明，在上述色譜條件下，溶劑及空白基質(zhì)在阿奇霉素及苯扎氯銨出峰位置無(wú)干擾，供試品溶液中苯扎氯銨及阿奇霉素分離度為6.78，分離度符合要求。

圖1 供試品溶液HPLC圖譜

3.2 定量限測(cè)定

3.2.1 阿奇霉素定量限測(cè)定 精密稱取阿奇霉素對(duì)照品30.0 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，再分別稀釋2 000～10 000倍不等，照上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得阿奇霉素定量限約為750 ng·mL－1(S/N=10)。

3.2.2 苯扎氯銨定量限測(cè)定 取苯扎氯銨對(duì)照品9.20 mg，置100 mL量瓶中，加枸櫞酸鹽緩沖液溶解并稀釋至刻度，精密量取1 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，再分別稀釋100～5 000倍不等，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，20 μL進(jìn)樣，測(cè)得阿奇霉素定量限約為46 ng·mL－1(S/N=10)。

3.3 線性與范圍

3.3.1 阿奇霉素的線性與范圍 精密稱取阿奇霉素對(duì)照品0.250 7 g，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取上述各溶液20 μL注入色譜儀，記錄色譜圖，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 阿奇霉素的線性關(guān)系表

以阿奇霉素濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，求得線性回歸方程為:A=1 672.6C+22.745，R2=0.999 9，n=5。阿奇霉素在 1.002 8 ～5.014 0 mg·mL－1濃度范圍內(nèi)，濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

3.3.2 苯扎氯銨的線性與范圍 精密稱取苯扎氯銨0.020 5 g，置50 mL量瓶中，加枸櫞酸鹽緩沖液(稱取0.5 g的枸櫞酸和0.5 g的枸櫞酸鈉，加水溶解并稀釋至100 mL)溶解，并稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液 3、4、5、6、7 mL，分別置200 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取各溶液20μL注入色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 苯扎氯銨的線性關(guān)系表

以苯扎氯銨濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，求得線性回歸方程為:A=27.907C －21.24，R2=0.999 3，n=5。苯扎氯銨在6.15 ～14.35 μg·mL－1濃度范圍內(nèi)，濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

3.3.3 方法的重復(fù)性 取阿奇霉素滴眼液3.0 g(約含阿奇霉素30 mg)，置10 mL量瓶中，加入0.06 g氯化鈉，強(qiáng)力振搖2 min，再用甲醇稀釋至刻度，搖勻，在3 000 r·min－1下離心20 min，取上層澄清液作為供試品溶液，平行制備6份;精密稱取阿奇霉素對(duì)照品適量，加甲醇溶解并定量稀釋制成每

1 mL中約含阿奇霉素3 mg的溶液，作為阿奇霉素對(duì)照品溶液;取苯扎氯銨對(duì)照品適量，加枸櫞酸鹽緩沖液溶解并稀釋制成每1 mL中約含苯扎氯銨0.18 mg的溶液，加甲醇定量稀釋制成每1 mL中約含苯扎氯銨9 μg的溶液，作為苯扎氯銨對(duì)照品溶液。分別精密量取上述各溶液20 μL注入色譜儀，記錄色譜圖，外標(biāo)法以峰面積計(jì)算阿奇霉素及苯扎氯銨的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 阿奇霉素及苯扎氯銨含量測(cè)定的方法重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

由上述結(jié)果可知，6平行樣品中阿奇霉素的平均含量為106.94%，RSD 為0.94%，苯扎氯銨的平均含量為100.04%，RSD為0.67%，證明本方法用于同時(shí)測(cè)定兩種成分含量的方法重復(fù)性良好。

3.3.4 儀器的重復(fù)性 取方法重復(fù)性項(xiàng)下樣品1供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 阿奇霉素及苯扎氯銨含量測(cè)定的儀器重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

由試驗(yàn)結(jié)果可知，阿奇霉素的平均含量為106.94%，RSD為0.57%，苯扎氯銨的平均含量為101.24，RSD 為1.52%，證明本儀器用于測(cè)定兩種物質(zhì)含量的重復(fù)性良好。

3.3.5 供試品溶液的穩(wěn)定性試驗(yàn) 取方法重復(fù)性項(xiàng)下供試品溶液，分別于 0、2、4、6、8 h 取 20 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 阿奇霉素及苯扎氯銨含量測(cè)定供試品溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

由試驗(yàn)結(jié)果可知，阿奇霉素的平均含量為106.74%，RSD為0.51%，苯扎氯銨的平均含量為99.90%，RSD為0.56%，證明各時(shí)間點(diǎn)供試品溶液中阿奇霉素及苯扎氯銨的峰面積變化均較小，說(shuō)明供試品溶液在8 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

3.3.6 回收率試驗(yàn)

3.3.6.1 阿奇霉素的回收率試驗(yàn) 取空白基質(zhì)約3.0g，精密稱定，置10 mL量瓶中，加入處方量80%、100%、120%的阿奇霉素原料，每個(gè)比例平行稱取3份樣品;另稱取0.06 g左右的氯化鈉于各樣品中，振搖使其溶解，加甲醇稀釋至刻度，置3 000 r·min－1下離心20 min，取上層澄清液作為阿奇霉素回收率樣品。精密量取上述各溶液20 μL注入色譜儀，記錄色譜圖。另取阿奇霉素對(duì)照品適量，用甲醇溶解并稀釋制成每1 mL中約含3 mg的溶液，作為阿奇霉素對(duì)照品溶液，同法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 阿奇霉素含量測(cè)定回收率試驗(yàn)

由試驗(yàn)結(jié)果可知，阿奇霉素平均回收率為100.68%，RSD為0.50%，說(shuō)明該方法可以滿足阿奇霉素的含量測(cè)定要求。

3.3.6.2 苯扎氯銨的回收率試驗(yàn) 稱取不含苯扎氯銨的樣品約3 g，精密稱定，置10 mL量瓶中，加入處方量80%、100%、120%的苯扎氯銨，每個(gè)比例平行稱取3份樣品;另稱取0.06 g的氯化鈉于樣品中，振搖使其溶解，用甲醇稀釋至刻度，置3 000 r·min－1下離心20 min，取上層澄清液作為苯扎氯銨回收率的樣品。分別精密量取各溶液20 μL注入色譜儀，記錄色譜圖。另取苯扎氯銨對(duì)照品適量，加枸櫞酸鹽緩沖液溶解并稀釋制成每1 mL中約含苯扎氯銨0.18 mg的溶液，再用甲醇定量稀釋制成每1 mL中約含苯扎氯銨9 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液，同法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 苯扎氯銨含量測(cè)定回收率試驗(yàn)

由試驗(yàn)結(jié)果可知，苯扎氯銨平均回收率為100.59%，RSD為0.92%，說(shuō)明該方法可以滿足苯扎氯銨的含量測(cè)定要求。

4 含量測(cè)定

照上述色譜條件及測(cè)定法連續(xù)測(cè)定三批阿奇霉素滴眼液中阿奇霉素及苯扎氯銨的含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表9。

表9 阿奇霉素滴眼液中阿奇霉素及苯扎氯銨的含量測(cè)定結(jié)果

5 結(jié)論

由上述試驗(yàn)結(jié)果可知，本方法采用一種色譜條件即可對(duì)阿奇霉素及苯扎氯銨的含量進(jìn)行控制，有效簡(jiǎn)化了檢測(cè)程序。經(jīng)試驗(yàn)結(jié)果證明，本方法準(zhǔn)確，簡(jiǎn)便，可行。

［1］國(guó)家食品藥品監(jiān)管局.關(guān)于修訂阿奇霉素氯化鈉注射液和阿奇霉素葡萄糖注射液藥品標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)事宜的公告［Z］.國(guó)食藥監(jiān)辦［2007］334號(hào)，2007.

［2］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版(二部)［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:附錄.

［3］易秋艷，范時(shí)根，楊梁.HPLC法測(cè)定注射用阿奇霉素的有關(guān)物質(zhì)［J］.西南國(guó)防醫(yī)藥，2008，18(5):656－658.