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    CHO細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果的影響

    2012-10-15 10:14:12夭建華米其利朱洲海李雪梅繆明明
    化學(xué)與生物工程 2012年12期
    關(guān)鍵詞:試物比色法培養(yǎng)箱

    夭建華,管 瑩,高 茜,米其利,朱洲海,李雪梅,繆明明

    (云南煙草科學(xué)研究院,云南 昆明650106)

    體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)作為一類重要的體外試驗(yàn),在新藥研發(fā)、化學(xué)物質(zhì)毒性評(píng)價(jià)方面發(fā)揮著重要的作用[1~5]。中性紅比色法和噻唑藍(lán)(MTT)比色法具有簡(jiǎn)便、快捷、靈敏等特點(diǎn),是目前應(yīng)用較多的毒理學(xué)檢測(cè)細(xì)胞毒性的方法。作為評(píng)價(jià)方法,其結(jié)果的可重復(fù)性十分重要。

    中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞毒理學(xué)試驗(yàn)。但CHO細(xì)胞連續(xù)傳代至一定代次后,在檢測(cè)參比標(biāo)準(zhǔn)樣品的細(xì)胞毒性時(shí),結(jié)果有顯著差異。為了尋找生物學(xué)狀態(tài)穩(wěn)定的連續(xù)傳代代次,作者在此比較了連續(xù)傳代培養(yǎng)的CHO細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征,并研究了CHO細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果的影響,擬為提高中性紅比色法和MTT比色法進(jìn)行細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)的穩(wěn)定性提供參考。

    1 實(shí)驗(yàn)

    1.1 試劑與儀器

    DMEM/F12(Solarbo 公 司),胎 牛 血 清 (美 國(guó)Klark),PBS,胰酶,中性紅(Sigma公司),二甲基亞砜(DMSO)。

    二氧化碳培養(yǎng)箱(Forma公司),96孔及24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning公司),酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司),半自動(dòng)轉(zhuǎn)盤式吸煙機(jī)(Borgwaldt RM20/CS)。

    1.2 卷煙煙氣樣品的制備[6]

    利用半自動(dòng)轉(zhuǎn)盤式吸煙機(jī)抽吸40支標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試用卷煙3R4F,用直徑92mm的劍橋?yàn)V片捕集燃吸后產(chǎn)生的煙氣總粒相物(TPM),稱重;將劍橋?yàn)V片放入三角瓶中,加入適量DMSO,置于超聲儀上超聲20min;用無菌濾紙過濾,收集TPM提取液,調(diào)整TPM在DMSO中的終濃度為10mg·mL-1;將樣品分裝后儲(chǔ)存于-80℃,待用。

    1.3 方法

    1.3.1 細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

    將CHO細(xì)胞復(fù)蘇后制成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度,接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),記為第1代細(xì)胞。待細(xì)胞匯合率達(dá)到80%時(shí),按1∶4比例傳代,匯合率再次達(dá)到80%時(shí)記為第3代細(xì)胞。以此類推,連續(xù)傳代至第17代。

    1.3.2 細(xì)胞形態(tài)的觀察

    細(xì)胞計(jì)數(shù)后接種于96孔板中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后,于倒置顯微鏡下觀察CHO細(xì)胞形態(tài),并拍照記錄。

    1.3.3 中性紅比色法測(cè)定受試物對(duì)細(xì)胞的毒性

    分別取第1、5、9、13、17代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CHO細(xì)胞,用胰酶進(jìn)行消化,吹打均勻,細(xì)胞計(jì)數(shù)后以5×104個(gè)·mL-1的細(xì)胞密度接種于96孔板中,每孔200μL,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;加入終濃度分別為10μg·mL-1、75μg·mL-1、120μg·mL-1、160μg·mL-1、200μg·mL-1的受試物,每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;加入濃度為100μg·mL-1的 中性紅DMEM無血清培養(yǎng)液,每孔200μL,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h;去除中性紅溶液,加入1%的甲醛溶液200μL,固定1min;去除固定液,每孔加入200μL中性紅萃取液(水∶乙醇∶乙酸 =49∶50∶1,現(xiàn)配),置于微量振蕩器上振蕩10min,用酶標(biāo)儀測(cè)量540nm處吸光度值。按下式計(jì)算細(xì)胞抑制率(X):

    式中:ODn、OD0、ODc分別為樣品、空白、細(xì)胞對(duì)照的多孔平均的吸光度值。

    1.3.4 MTT比色法測(cè)定受試物對(duì)細(xì)胞的毒性

    分別取第1、5、9、13、17代對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CHO細(xì)胞,用胰酶進(jìn)行消化,吹打均勻,細(xì)胞計(jì)數(shù)后分別以5×104個(gè)·mL-1的細(xì)胞密度接種于96孔板中,每孔200μL,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;加入終濃度分別為10μg·mL-1、75μg·mL-1、120μg·mL-1、160μg·mL-1、200μg·mL-1的受試物,每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h;加入濃度為5mg·mL-1的 MTT溶液,每孔20μL,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3h;去除溶液,加入DMSO溶液,每孔200μL,置于微量振蕩器上振蕩10min,用酶標(biāo)儀測(cè)量490nm處吸光度值,計(jì)算細(xì)胞抑制率。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 細(xì)胞形態(tài)(圖1)

    圖1 光鏡下CHO細(xì)胞的形態(tài)(×200)Fig.1 Morphology of CHO cells under light microscopy

    由圖1可見,培養(yǎng)初期(第1代),細(xì)胞呈短梭狀,包漿折光性強(qiáng),邊界清晰,排列整齊有序(圖1a);培養(yǎng)中期(第5代、第9代),細(xì)胞開始呈長(zhǎng)梭狀,包漿折光性變?nèi)酰吔绶置?,排列整齊(圖1b、c);培養(yǎng)后期(第13代、第17代),胞體扁平且寬大,形態(tài)不規(guī)則,邊界模糊,排列凌亂無序,包漿內(nèi)累積大量細(xì)小顆粒(圖1d、e)。

    2.2 細(xì)胞代次對(duì)受試物細(xì)胞抑制率的影響

    分別采用中性紅比色法以及MTT比色法檢測(cè)3R4F參比卷煙煙氣受試劑量為10μg·mL-1、75μg·mL-1、120μg·mL-1、160μg·mL-1、200μg·mL-1時(shí)的CHO細(xì)胞抑制率,結(jié)果見圖2。

    圖2 中性紅比色法(a)和MTT比色法(b)測(cè)定同一受試物對(duì)不同代次CHO細(xì)胞的抑制率Fig.2 Inhibition rate of the same inhibitor to CHO cells in different passages determined by neutral red assay(a)and MTT assay(b)

    由圖2a可以看出,采用中性紅比色法測(cè)試CHO細(xì)胞抑制率,隨著細(xì)胞代次的升高,同一受試劑量下受試物對(duì)CHO細(xì)胞的抑制率總體呈上升趨勢(shì)。其中第1代、第5代以及第9代3個(gè)試驗(yàn)組的細(xì)胞抑制率較為一致,而第13代和第17代2個(gè)試驗(yàn)組的測(cè)定結(jié)果與其余3個(gè)試驗(yàn)組有顯著差異(P<0.05)。

    由圖2b可以看出,采用MTT比色法測(cè)試CHO細(xì)胞抑制率,隨著細(xì)胞代次的升高,同一受試劑量下受試物對(duì)CHO細(xì)胞的抑制率呈上升趨勢(shì)。其中第1代、第5代、第9代以及第13代4個(gè)試驗(yàn)組的細(xì)胞抑制率較為一致,而第17代測(cè)定結(jié)果與其余4個(gè)試驗(yàn)組有顯著差異(P<0.05)。

    2.3 討論

    目前CHO細(xì)胞被國(guó)內(nèi)外多家煙草公司用于體外細(xì)胞毒性試驗(yàn),以評(píng)價(jià)卷煙煙氣的生物學(xué)毒性[7,8]。該細(xì)胞具有永生性,屬無限細(xì)胞系,理論上具有無限傳代的壽命。有研究報(bào)道,STO永生細(xì)胞系長(zhǎng)期的連續(xù)傳代會(huì)對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能特性造成影響[9]。那么同樣具有永生性的CHO細(xì)胞,長(zhǎng)期連續(xù)傳代培養(yǎng)是否同樣會(huì)對(duì)其結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響[10,11],目前還未見報(bào)道。

    本研究對(duì)連續(xù)傳代的CHO細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行了觀察。結(jié)果顯示,隨著細(xì)胞連續(xù)傳代代次的升高,CHO細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了明顯的退行性變化。從培養(yǎng)初期的呈短梭狀、包漿折光性強(qiáng)、邊界清晰、排列整齊有序的狀態(tài)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)榕囵B(yǎng)后期的扁平且寬大、形態(tài)不規(guī)則、邊界模糊、包漿內(nèi)累積大量細(xì)小顆粒、排列凌亂無序的狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)超過9代后,細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的衰老狀態(tài)。

    為了進(jìn)一步檢測(cè)長(zhǎng)期連續(xù)傳代培養(yǎng)對(duì)CHO細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的差異是否會(huì)對(duì)細(xì)胞毒性試驗(yàn)的結(jié)果產(chǎn)生影響,分別取不同代次的CHO對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,利用中性紅比色法以及MTT比色法對(duì)3R4F參比卷煙煙氣受試劑量為10μg·mL-1、75μg·mL-1、120μg·mL-1、160μg·mL-1、200μg·mL-1時(shí)的CHO細(xì)胞抑制率進(jìn)行檢測(cè)。無論是中性紅比色法還是MTT比色法測(cè)定的結(jié)果均顯示,隨著細(xì)胞代次的升高,同一受試劑量下受試物對(duì)CHO細(xì)胞的抑制率均呈上升趨勢(shì)。

    用連續(xù)培養(yǎng)9代以內(nèi)的CHO細(xì)胞進(jìn)行中性紅細(xì)胞毒性試驗(yàn)的結(jié)果較為一致,而連續(xù)培養(yǎng)13代以內(nèi)的CHO細(xì)胞進(jìn)行MTT細(xì)胞毒性試驗(yàn)的結(jié)果無顯著差異。從兩種方法檢測(cè)得到的細(xì)胞代次對(duì)細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果的不同影響可以看出,中性紅比色法較MTT比色法對(duì)細(xì)胞的衰老更為靈敏。這可能是由于,中性紅作為一種陽(yáng)離子活性染料,以離子擴(kuò)散方式進(jìn)入細(xì)胞膜并與溶酶體基質(zhì)的陰離子部分結(jié)合[3]。伴隨著細(xì)胞的衰老,細(xì)胞膜的通透性發(fā)生了改變(對(duì)細(xì)胞的形態(tài)進(jìn)行觀察可以清楚看到,隨著細(xì)胞代次的升高,細(xì)胞邊界變得模糊,細(xì)胞膜大面積損傷),導(dǎo)致中性紅的攝入下降。而作為針對(duì)活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶的MTT比色法對(duì)細(xì)胞衰老的反應(yīng)相對(duì)滯后。

    無論是用中性紅比色法還是MTT比色法對(duì)受試物的細(xì)胞毒性進(jìn)行檢測(cè),隨著細(xì)胞連續(xù)傳代代次的升高,同一受試物在相同劑量下對(duì)細(xì)胞的抑制率均呈上升趨勢(shì)。這說明細(xì)胞代次的確是影響中性紅比色法和MTT比色法檢測(cè)穩(wěn)定性的重要因素。因此,為了提高細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性以及可比性,細(xì)胞的連續(xù)傳代培養(yǎng)代次是重要的控制因素。

    3 結(jié)論

    研究了CHO細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果的影響。對(duì)不同代次CHO細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察,并利用中性紅比色法、MTT比色法檢測(cè)同種受試物對(duì)不同代次CHO細(xì)胞的抑制率是否有顯著差異。結(jié)果表明:隨著細(xì)胞代次的升高,細(xì)胞的形態(tài)、胞漿折光性、邊界、排列均發(fā)生了改變;同種受試物對(duì)CHO細(xì)胞的抑制率隨細(xì)胞代次的升高呈上升趨勢(shì);中性紅比色法較MTT比色法對(duì)細(xì)胞的衰老更靈敏。為了提高細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性以及可比性,細(xì)胞代次是需要控制的重要因素。

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