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    梔子黃色素的精制及梔子藍色素的轉(zhuǎn)化

    2012-10-15 10:14:10景艷艷李世杰陳茂彬方尚玲
    化學與生物工程 2012年12期

    景艷艷,李世杰,陳茂彬,蔣 威,方尚玲

    (教育部發(fā)酵工程重點實驗室,湖北工業(yè)大學生物工程學院,湖北 武漢430068)

    梔子果是茜草科植物梔子的果實,含有兩種色素:梔子苷(京尼平苷)和類胡蘿卜素類的梔子黃色素(藏花素)。梔子黃色素精制過程洗脫的廢液中含有梔子苷。研究表明:梔子苷在β-葡萄糖苷酶或β-半乳糖苷酶的作用下,可與伯氨基酸(α-氨基酸)發(fā)生聚合反應,生成藍色色素[1]。近幾年來,用于生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株多為黑曲霉、木霉等霉菌屬,桿菌屬的菌株較少。作者從土壤及菌種保藏室中篩選到4株霉菌、2株桿菌,并利用它們將梔子黃色素精制廢液(梔子黃廢液)轉(zhuǎn)化為梔子藍色素,變廢為寶,以充分循環(huán)利用梔子資源。

    1 實驗

    1.1 材料、菌株與培養(yǎng)基

    梔子果,市售。

    蘇云金芽孢桿菌BT、蘇云金芽孢桿菌BT-140、巨大芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌BT-7216、嗜熱脂肪桿菌和枯草芽孢桿菌,分別編號1?!?#,湖北工業(yè)大學菌種保藏室。

    桿菌斜面培養(yǎng)基[2]:葡萄糖2%,蛋白胨1%,NaCl 0.5%,NaNO30.3%,瓊脂2%,pH 值7.0。

    桿菌種子培養(yǎng)基[2]:葡萄糖2%,蛋白胨1%,NaCl 0.5%,NaNO30.3%,pH 值7.0。

    桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基:麩皮2%(麩皮加水煮沸后經(jīng)4層紗布過濾得到的濾液),蛋白胨2%,梔子黃廢液10%,KH2PO40.2%,MgSO4·7H2O 0.2%,pH 值7.0。

    初篩培養(yǎng)基:葡萄糖2%,蛋白胨2%,酵母膏1%,梔子黃廢液10%。

    平板分離培養(yǎng)基:梔子黃廢液10%,谷氨酸鈉0.1%,蛋白胨0.5%,KH2PO41%,MgSO4·7H2O 0.05%,瓊脂2%。

    PDA培養(yǎng)基:土豆20g,葡萄糖2g,瓊脂2g,水100mL,115℃滅菌30min。

    霉菌種子培養(yǎng)基:葡萄糖1%,酵母膏0.5%,NaNO30.3%,MgSO4·7H2O 0.2%,KH2PO40.2%。

    霉菌發(fā)酵培養(yǎng)基:麩皮2%(麩皮加水煮沸后經(jīng)4層紗布過濾得到的濾液),蛋白胨2%,KH2PO40.2%,MgSO4·7H2O 0.2%,梔子黃廢液10%。

    1.2 方法

    1.2.1 梔子黃色素的提取

    準確稱取經(jīng)粉碎機粉碎后的梔子果粉末15g,加入150mL水,60℃水浴30min,過濾,得1次提取液;濾渣加100mL水再次浸提,過濾,得2次提取液;濾渣加50mL水第3次浸提,過濾,得3次提取液。將3次提取液混合,備用。

    1.2.2 梔子黃色素的精制

    1.2.2.1 樹脂的預處理

    AB-8型大孔吸附樹脂經(jīng)除雜、80%乙醇浸泡24h充分溶脹后,用80%乙醇洗至洗出液加等體積水無渾濁現(xiàn)象,再用去離子水洗至無醇味。

    1.2.2.2 樹脂的吸附和解吸

    稱取1g預處理后的AB-8型大孔吸附樹脂于250mL錐形瓶中,加入50mL梔子黃色素提取液,于30℃、150r·min-1搖床振蕩過夜至吸附平衡,測吸附前后色素溶液在440nm(梔子黃色素的最大吸收波長)處的吸光度值。

    稱取吸附平衡的AB-8型大孔吸附樹脂0.5g,加25mL 60%乙醇,于30 ℃、150r·min-1搖床振蕩24h,測解吸后60%乙醇中梔子黃色素在440nm處的吸光度值。按下式計算吸附率和解吸率:

    式中:A1為吸附前梔子黃色素提取液在440nm處的吸光度值;A2為吸附平衡后梔子黃色素提取液在440nm處的吸光度值;A3為解吸后60%乙醇中梔子黃色素在440nm處的吸光度值。

    1.2.2.3 梔子黃色素的精制

    取吸附平衡的AB-8型大孔吸附樹脂,裝柱。依次用去離子水(4BV)、20%乙醇(5BV)、60%乙醇(6.5BV)進行洗脫,流速為1.5mL·min-1。收集60%乙醇的洗脫液,經(jīng)濃縮干燥得梔子黃色素精品。剩余的洗脫液即為含大量梔子苷的梔子黃廢液,再經(jīng)濃縮去醇,置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.3 梔子藍色素轉(zhuǎn)化菌的篩選

    1.2.3.1 土壤中目的菌株的篩選

    初篩:稱取1g土樣加入20mL無菌水充分振蕩制成懸液。吸取1mL土樣懸液于裝有50mL初篩培養(yǎng)基的250mL搖瓶中,于30℃、180r·min-1搖床培養(yǎng)2d。若搖瓶培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)搖瓶內(nèi)發(fā)酵液變藍,說明含有目的菌株。

    平板分離:取初篩培養(yǎng)基中的菌液作梯度稀釋。取不同稀釋梯度的菌懸液0.2mL涂布在平板分離培養(yǎng)基于30℃PHX型智能生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)觀察。挑取能在平板分離培養(yǎng)基上產(chǎn)生藍色菌圈的菌株劃線分離,得到單菌落。

    復篩:挑取單菌落接種到初篩培養(yǎng)基中,于30℃、180r·min-1搖床培養(yǎng)2~3d,發(fā)酵液轉(zhuǎn)藍的搖瓶對應的菌株即為目的菌株,將其接種到PDA培養(yǎng)基上作菌種斜面保藏。

    1.2.3.2 桿菌的篩選

    分別挑取5環(huán)斜面活化后的桿菌于種子液中,于35℃、180r·min-1搖床培養(yǎng)10h,以10%接種量接種到桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)24h,發(fā)酵液轉(zhuǎn)藍所對應的菌株即為目的菌株。

    1.2.4 目的菌株轉(zhuǎn)藍發(fā)酵培養(yǎng)

    將篩選得到的目的菌株進行轉(zhuǎn)藍發(fā)酵培養(yǎng):4株從土壤中篩選得到的目的菌株在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d再轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基于30℃搖床培養(yǎng)5d,轉(zhuǎn)藍發(fā)酵液稀釋10倍;蘇云金芽孢桿菌BT-7216和枯草芽孢桿菌在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)10h后以10%接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h,平行實驗3次,轉(zhuǎn)藍發(fā)酵液稀釋3倍。

    取上述發(fā)酵液以10 000r·min-1離心10min,取上清液檢測590nm處吸光度值。以去離子水為對照。

    按下式計算發(fā)酵液色價(E1%1cm):

    式中:OD590為吸光度值;f為稀釋倍數(shù);V為發(fā)酵液總體積的1%,mL。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 AB-8型大孔吸附樹脂的吸附、解吸效果

    實驗發(fā)現(xiàn),AB-8型大孔吸附樹脂對梔子黃色素的吸附率達到88.92%、解吸率達到95.38%,吸附率和解吸率都較高,可用于梔子黃色素的精制。

    2.2 梔子黃色素精制前后吸收光譜分析(圖1)

    圖1 梔子黃色素提取液(a)、梔子黃廢液(b)、梔子黃色素精制品(c)的吸收光譜Fig.1 The absorption spectra of gardenia yellow pigment extract(a),gardenia yellow waste(b)and purified gardenia yellow pigment(c)

    由圖1可知,梔子黃色素提取液的吸收光譜中,峰1在440nm處,為藏花素和藏花酸的特征吸收峰,梔子黃色素是一種罕見的水溶性類胡蘿卜素,主要成分是類胡蘿卜素類的α-藏花素和藏花酸[3];峰2為雜質(zhì)峰;峰3在325nm附近,為綠原酸的特征吸收峰;峰4在238nm處,為梔子苷的特征吸收峰。梔子黃廢液的吸收光譜中,梔子苷的含量很高,已經(jīng)超出了最大測量值,說明梔子黃廢液可以作為梔子藍色素微生物轉(zhuǎn)化的原料。梔子黃色素精制品的吸收光譜中,梔子苷的吸收峰不明顯,由此可見梔子黃色素精制后梔子苷的含量明顯減少;同時325nm處的吸光度與440nm處的吸光度比值由2.32下降到1.16,說明精制過程中除去了大量綠原酸。

    2.3 轉(zhuǎn)藍發(fā)酵液吸收光譜分析

    土壤中目的菌株的初篩培養(yǎng)液以及桿菌篩選發(fā)酵液都有藍色色素,為確定該色素是否為梔子藍色素,對轉(zhuǎn)藍發(fā)酵液進行吸收光譜掃描,見圖2。

    圖2 轉(zhuǎn)藍發(fā)酵液的吸收光譜Fig.2 The absorption spectrum of the fermentation broth for converting blue

    由圖2可知,590nm處有一吸收峰,這與梔子藍色素的最大吸收波長為590nm相一致[4],可確定梔子黃廢液經(jīng)微生物發(fā)酵轉(zhuǎn)化為了梔子藍色素。

    2.4 桿菌的篩選

    7株桿菌中有6株發(fā)酵液有顏色變化,測定其580~600nm處吸光度值,發(fā)現(xiàn)6株桿菌轉(zhuǎn)藍發(fā)酵液的吸收峰值都在590nm附近。7株桿菌發(fā)酵轉(zhuǎn)藍情況比較見表1 。

    表1 7株桿菌發(fā)酵轉(zhuǎn)藍比較Tab.1 Comparison of the fermentation for converting blue of the seven Bacillus strains

    由表1 可知,7株桿菌的轉(zhuǎn)藍發(fā)酵液稀釋3倍后吸光度值較大的是蘇云金芽孢桿菌BT-7216和枯草芽孢桿菌,同時兩者發(fā)酵液的顏色呈藍色,色澤較好。因此,選擇蘇云金芽孢桿菌BT-7216和枯草芽孢桿菌進一步馴化比較。

    2.5 梔子黃廢液轉(zhuǎn)藍發(fā)酵

    從土壤中篩選得到4株目的菌株,分別編號1#~4#,其菌落形態(tài)見圖3。

    圖3 4株目的菌株的形態(tài)Fig.3 Morphology of the four object strains

    由圖3可知,4株目的菌株屬于霉菌屬。

    4株霉菌、2株桿菌轉(zhuǎn)藍發(fā)酵液的吸光度值和色價見表2 。

    表2 4株霉菌、2株桿菌轉(zhuǎn)藍發(fā)酵液的吸光度值和色價Tab.2 The absorbance values and color values of fermentation broth of the four molds and the two Bacillus strains

    由表2 可知,從土壤中篩選得到的4株霉菌在梔子黃廢液轉(zhuǎn)藍發(fā)酵過程中效果較突出的是2#和4#菌株,發(fā)酵液經(jīng)稀釋10倍后吸光度值分別達0.258、0.343,色價(590nm)分別為129.0、171.5;枯草芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌BT-7216轉(zhuǎn)藍發(fā)酵液稀釋3倍后,吸光度值分別達0.326、0.260,色價(590nm)分別為48.9、39.0,其中枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)藍效果較好。

    2.6 討論

    (1)在培養(yǎng)過程中,目的菌株可分解培養(yǎng)基中的蛋白胨為氨基酸,同時分泌出β-葡萄糖苷酶,在β-葡萄糖苷酶作用下將梔子黃廢液轉(zhuǎn)化為梔子藍色素。

    (2)本研究的色價計算為發(fā)酵液的色價,而通常是將發(fā)酵液換算成色素粉末來計算色價,那樣其色價將更高。

    3 結(jié)論

    (1)梔子黃色素提取液經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂吸附,裝柱后依次經(jīng)去離子水、20%乙醇、60%乙醇動態(tài)洗脫,除去大量雜質(zhì)得到高純度的梔子黃色素,梔子黃色素精制后的廢液中含有大量的梔子苷,可用于梔子藍色素的微生物轉(zhuǎn)化。

    (2)經(jīng)初篩、復篩、轉(zhuǎn)藍發(fā)酵培養(yǎng),從土壤中篩選得到4株霉菌,其中2#和4#菌株為優(yōu)勢菌株,轉(zhuǎn)藍發(fā)酵液稀釋10倍后590nm處吸光度值分別達到0.258、0.343,發(fā)酵液色價 E1%1cm(590nm)分別為 129.0、171.5,達到了國際市場標準。

    (3)從菌種保藏室中的7株桿菌中篩選到轉(zhuǎn)藍效果較好的2株桿菌,其中枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)藍效果更好,轉(zhuǎn)藍發(fā)酵液稀釋3倍后590nm處吸光度值為0.326,發(fā)酵液色價E1%1cm(590nm)為48.9。與霉菌相比,桿菌的轉(zhuǎn)藍發(fā)酵液色價較低,但用桿菌轉(zhuǎn)藍發(fā)酵周期短、效率高,其應用潛力很大,可對其轉(zhuǎn)藍發(fā)酵工藝進行優(yōu)化,提高轉(zhuǎn)藍效率。

    [1]趙墾田.植物精深產(chǎn)品加工工藝學[M].哈爾濱:東北林業(yè)大學出版社,2007:63.

    [2]方尚玲,劉源才,張慶華,等.細菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶發(fā)酵優(yōu)化[J].化學與生物工程,2007,24(9):54-58.

    [3]李煒.梔子果化學成分的綜合應用研究[D].北京:北京林業(yè)大學,2006.

    [4]楊志,張芳,李梅,等.梔子藍色素制備及純化工藝的研究[J].現(xiàn)代食品科技,2008,24(4):352-356.

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