ECRG4基因在人胃腺癌組織中的表達(dá)及意義

方 圓，馬 黨，危文素，徐 鐳，付 泊，劉 展

（湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖南 長沙 410005）

食管癌相關(guān)基因4(Esophageal Cancer Related Gene 4，ECRG4)是我國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所于1998年首次克隆和鑒定的食管癌相關(guān)新基因，并在Genbank(AF268198)登記[1]。ECRG4在人體正常組織中廣泛表達(dá)，Northern blot分析表明，ECRG4在所有檢測的組織中包括心、腦、胎盤、肺、肝、骨骼肌、腎、前列腺和胰腺等都表達(dá)[2]。研究顯示，ECRG4是新的候選抑癌基因，是多種腫瘤預(yù)后的候選標(biāo)志物，ECRG4不僅僅是與腫瘤的生長與侵襲有關(guān)，同樣也與細(xì)胞的變異和凋亡有著密不可分的聯(lián)系[2-5]。啟動子高甲基化是ECRG4在腫瘤發(fā)生過程中轉(zhuǎn)錄失活的主要機(jī)制[6]。ECRG4可能通過參與NF-κB通路調(diào)控COX-2的表達(dá)來發(fā)揮其抑癌功能[7]。ECRG4基因與胃腺癌的發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性研究，目前國內(nèi)外尚無報(bào)道。本研究通過免疫組織化學(xué)的方法研究ECRG4基因在胃腺癌組織、癌旁組織及正常胃組織中的表達(dá)差異及其與患者臨床病理特征的相關(guān)性，從而為胃癌的基因診治及分子靶向治療提供新的思路和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

收集湖南省人民醫(yī)院2009年1月～2011年12月胃癌手術(shù)后病理科保存胃癌石蠟標(biāo)本58例作為胃癌組，其中男性36例，女性22例。年齡30～80歲(平均57.95歲)。收集癌旁組織(距腫瘤邊緣2～5cm取材)15例作為癌旁組、同期術(shù)后證實(shí)為良性疾病的胃組織15例作為正常組。所有標(biāo)本均有臨床病理資料記錄相匹配。所有標(biāo)本均經(jīng)過病理診斷證實(shí)，患者術(shù)前均未接受放化療。ECRG4多克隆抗體(Rabbit anti-ECRG4，Catalog C11679) 購自 Assay-Biotech公司；即用型非生物素免疫組化EliVisionTMsuper檢測試劑盒(KIT-9923)、DAB顯色劑、檸檬酸抗原修復(fù)液及PBS緩沖液粉劑等均購自福州邁新生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 制片及資料分類

全部石蠟標(biāo)本連續(xù)切片，切片厚度4 μm，首先經(jīng)HE染色病理組織學(xué)證實(shí)后再采用免疫組織化學(xué)SP法檢測胃癌組織、癌旁組織及正常胃組織ECRG4表達(dá)。嚴(yán)格按照試劑盒說明書所示步驟操作，取ECRG4一抗稀釋濃度為1:50。用PBS代替一抗作為陰性對照，用食道組織切片作為陽性對照。試驗(yàn)組所有病例均根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟第4版胃癌TNM分期系統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，按性別、年齡、腫瘤發(fā)生部位、組織分化程度、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移進(jìn)行分類。

1.2.2 閱片及判定標(biāo)準(zhǔn)

采用半定量分析，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察，按陽性著色范圍和陽性著色強(qiáng)度分別計(jì)分：陽性范圍無為 0分，＜30%為1分，31%～60%為2分，＞60%為3分；陽性強(qiáng)度弱(基本不著色)為0分，中(淡黃色)1分，強(qiáng)(棕黃色)2分，極強(qiáng)(棕黑色)3分。陽性范圍和強(qiáng)度的評分相乘，即為陽性積分，取5個(gè)視野的平均陽性積分為該例的陽性積分；每例陽性積分0～1分為陰性，2分為弱陽性，3分為陽性，4分及以上為強(qiáng)陽性。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,定性資料率的比較采用卡方檢驗(yàn);非參數(shù)檢驗(yàn)用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)、Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，以α=0.05作為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 ECRG4蛋白在胃癌組織、癌旁組織及正常胃組織的表達(dá)特點(diǎn)

ECRG4蛋白在胃腺癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)或缺失，在癌旁組織中部分下調(diào)或缺失，而在胃正常組織普遍表達(dá)。光學(xué)顯微鏡下可見淡黃至棕黃色著色即為陽性表達(dá)，主要定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜。ECRG4蛋白在胃癌組中陰性表達(dá)29例、弱陽性表達(dá)29例、未見陽性及強(qiáng)陽性表達(dá)；癌旁組織中陰性表達(dá)0例、弱陽性表達(dá)5例、陽性表達(dá)7例、強(qiáng)陽性表達(dá)3例；正常胃組織中陰性表達(dá)1例、弱陽性表達(dá)4例、陽性表達(dá)2例、強(qiáng)陽性表達(dá)8例(圖1)。三者比較以秩轉(zhuǎn)換的非參數(shù)檢驗(yàn)Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)得P＜0.001，可認(rèn)為胃癌組織、癌旁組織及正常胃組織ECRG4蛋白表達(dá)有差別。組間兩兩比較以Wilcoxon秩和檢驗(yàn)得正常組與胃癌組、癌旁組與胃癌組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），可認(rèn)為胃癌組織與正常胃組織、胃癌組織與癌旁組織ECRG4蛋白表達(dá)有差別。而正常組與癌旁組比較，P＞0.05，認(rèn)為正常胃組織與胃癌癌旁組織ECRG4蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

圖1 IHC所示ECRG4蛋白在胃腺癌、癌旁及正常胃組織中的表達(dá)

2.2 ECRG4蛋白表達(dá)與胃腺癌患者的臨床病理特征的關(guān)系

ECRG4的表達(dá)與胃癌患者的分化程度有關(guān)，分化程度越低者其表達(dá)缺失率越高 (χ2=8.357，P＜0.05)。ECRG4蛋白表達(dá)與病人年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位、TNM分期及是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān) (χ2=0.284～2.636，P＞0.05)，見表 1。

3 討論

食管癌相關(guān)基因4(ECRG4)是我國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)腫瘤研究所首次克隆和鑒定的食管癌相關(guān)新基因，并在Genbank(AF268198)登記，蘇濤[1]等利用差異顯示PCR(DD-PCR)法，比較了取自河南林縣高癌家族的食管癌組織和對應(yīng)癌旁正常組織標(biāo)本，分離出4條表達(dá)差異的表達(dá)序列標(biāo)簽 (expressed sequence tag，EST)片段，命名為食管癌相關(guān)基因1-4(Esophageal Cancer Related Genes，ECRG1-4)。 畢美霞[8]等采用RACE技術(shù)和計(jì)算機(jī)克隆兩種方法分離和鑒定了ECRG4 cDNA的全長，得到一致的結(jié)果，并在Genbank(AF268198)登記。NCBI將與ECRG4來源于同一基因的EST序列歸為一個(gè)唯一序列族(Unigene Cluster)Hs.43125，該序列族存在從同一始祖進(jìn)化而來的兩種定向進(jìn)化同源基因Mm.11819(Unigene Cluster，Mus musculus) 和 Rn.16593(Unigene Cluster，RAT)。 ECRG4 基因定位于 2q12.2，全長跨度約12,500bp，含有一個(gè)444bp的完整編碼框和四個(gè)外顯子，編碼由148個(gè)氨基酸組成的多肽，ECRG4蛋白約17KD。激光掃描共聚焦顯微鏡成像顯示，內(nèi)源性和外源性ECRG4蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜。ECRG4在人體正常組織中廣泛表達(dá)，Northern blot分析表明，ECRG4在所有檢測的組織中包括心、腦、胎盤、肺、肝、骨骼肌、腎、前列腺和胰腺等[2]都表達(dá)。

研究顯示，ECRG4是新的候選抑癌基因，是多種腫瘤預(yù)后的候選標(biāo)志物。ECRG4不僅僅是與腫瘤的生長與侵襲有關(guān)，同樣也與細(xì)胞的變異和凋亡有著密不可分的聯(lián)系[2-5]。研究表明，啟動子高甲基化是ECRG4在腫瘤發(fā)生過程中轉(zhuǎn)錄失活的主要機(jī)制[6]。ECRG4可能通過參與NF-κB通路調(diào)控COX-2的表達(dá)來發(fā)揮其抑癌功能[7-8]。ECRG4重組蛋白可作為某些腫瘤的潛在治療藥物。ECRG4能夠延緩細(xì)胞周期進(jìn)程，如神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、食管癌EC9706等的研究中，ECRG4的作用主要表現(xiàn)在從細(xì)胞G1期到S期延緩細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制細(xì)胞的遷移力和侵襲力[9-10]。

胃癌(carcinoma of stomach)是起源于胃上皮的惡性腫瘤，是最常見的惡性腫瘤之一。世界上不同國家與地區(qū)胃癌的發(fā)病率有明顯差別。我國屬胃癌較高發(fā)病區(qū)，但各地也有較大差異。盡管在過去的數(shù)十年中，在胃癌的診斷和治療方面有了較大進(jìn)展，但是胃癌的5年生存率仍然很低。因此，了解胃癌的病因及加強(qiáng)胃癌的預(yù)防對于胃癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療至關(guān)重要。胃癌的病因和發(fā)病機(jī)制尚未闡明，研究資料表明胃癌的發(fā)生是多因素作用的結(jié)果。目前認(rèn)為與環(huán)境、感染、遺傳、基因調(diào)控、癌前期變化等有關(guān)[11]。胃癌的發(fā)展經(jīng)歷一個(gè)相當(dāng)漫長的演變階段，既有階段性又有連續(xù)性，涉及多種癌基因、抑癌基因、生長因子及其受體、細(xì)胞粘附分子及DNA修復(fù)基因等的異常和積累[11]。

ECRG4基因與人胃癌的發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性目前國內(nèi)外尚未見研究報(bào)道。本試驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)的方法首次初步研究了ECRG4蛋白在人胃腺癌組織、癌旁組織及正常胃組織的表達(dá)差異，結(jié)果以半定量的方法經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)比較后發(fā)現(xiàn)，ECRG4蛋白在胃腺癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)或缺失，在癌旁組織中部分下調(diào)或缺失，而在胃正常組織普遍表達(dá)。光學(xué)顯微鏡下陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜。ECRG4蛋白在胃癌組中陰性表達(dá)29例、弱陽性表達(dá)29例、未見陽性及強(qiáng)陽性表達(dá)；癌旁組織中陰性表達(dá)0例、弱陽性表達(dá)5例、陽性表達(dá)7例、強(qiáng)陽性表達(dá)3例；正常胃組織中陰性表達(dá)1例、弱陽性表達(dá)4例、陽性表達(dá)2例、強(qiáng)陽性表達(dá)8例；胃癌組織、癌旁組織及正常胃組織ECRG4蛋白表達(dá)差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。組間兩兩比較胃癌組織與正常胃組織、胃癌組織與癌旁組織ECRG4蛋白表達(dá)有差異。而正常組與癌旁組比較，ECRG4蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與臨床病理相聯(lián)系顯示，ECRG4的表達(dá)與胃癌患者的分化程度有關(guān)，分化程度越低者其表達(dá)缺失率越高,ECRG4蛋白表達(dá)與病人年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位、TNM分期及是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)。

抑癌基因的失活導(dǎo)致正常細(xì)胞逐步向惡性表型轉(zhuǎn)化一直是近年來的研究熱點(diǎn)。ECRG4可能通過阻斷異常的NF-κB通路的激活，抑制COX-2的表達(dá)和功能來發(fā)揮其抑癌作用[7]。ECRG4作為新的人類腫瘤的候選抑癌基因，為相關(guān)腫瘤的基因治療提供了新的方向和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但ECRG4發(fā)揮作用的信號傳導(dǎo)通路及與之直接作用的因子或基因尚不清楚，有關(guān)其具體的作用方式還需進(jìn)一步探討，本研究初步探討了ECRG4在胃腺癌的表達(dá)情況，旨在為胃癌的基因診治及分子靶向治療提供新的思路和依據(jù)。

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