HPLC法測(cè)定三七止血膠囊中三七總皂苷含量研究

肖 遐 ，陽(yáng)國(guó)平

（1.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410013;2.湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410013）

三七止血膠囊國(guó)家最新批準(zhǔn)上市的新藥，其處方來源于《金匱要略》、《傷寒論》，由三七和地錦草兩味藥材組成。本品能止出血、散瘀血、消腫止痛三大功效[1]。維持凝血與抗纖溶動(dòng)態(tài)平衡，有利于止血而不留瘀[2]；抗菌消炎、消腫定痛，有助于傷口早日愈合。因此本品能顯著減少出血，減輕疼痛，用于消化道出血、血尿、便血、吐血，血痢，月經(jīng)不調(diào)，人流及產(chǎn)后流血不止，功能性子宮出血，痛經(jīng)等。血崩，產(chǎn)后血流不止，月經(jīng)過多及外傷出血。是治療各種出血和傷科的首選藥[3,4]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-10ATvp高效液相色譜儀；HW2-000色譜工作站。 BO211D電子分析天平(西德Sartorious)；精密度試紙。

1.2 試藥

乙腈均為色譜試劑，水為重蒸水，其它試劑均為分析純。三七止血膠囊：湖南德康制藥股份有限公司；三七止血膠囊對(duì)照品：三七皂苷R1批號(hào)110745-200915,人參皂苷Rg1批號(hào)110703-200924,人參皂苷Rb1批號(hào)110704-200920(均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供)。

2 含量測(cè)定

三七總皂苷是三七止血膠囊中發(fā)揮藥效的主要化學(xué)物質(zhì)，其含量的多少是決定藥效的關(guān)鍵因素，目前三七止血膠囊并沒有對(duì)應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，而是借用《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑 第十一冊(cè)中收載的三七止血片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[5]。但從藥代動(dòng)力學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)三七止血膠囊的吸收和藥效作用優(yōu)于三七止血片[6]，因此沒有專門的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)這一問題日益嚴(yán)重。需要通過一系列方法學(xué)研究得到最準(zhǔn)確的三七止血膠囊中的三七總皂苷的含量測(cè)定的方法，并且需嚴(yán)格按照《中國(guó)藥典》2008年版一部附錄ⅠL的膠囊劑項(xiàng)下有關(guān)的各項(xiàng)規(guī)定對(duì)樣品質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)斷其是否合格[7]。

2.1 色譜條件

色譜柱：C18(Alltima 250×4.6mm，5μL);流動(dòng)相：以流動(dòng)相A：乙腈，流動(dòng)相B：水，采用梯度洗脫方式，按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫：

表1 梯度洗脫流動(dòng)相成分表

2.2 供試品溶液的制備

取裝量差異項(xiàng)下的內(nèi)容物約1g，精密稱定，置于索氏提取器中，加甲醇適量，加熱回流6 h，取甲醇液置水浴上蒸干。殘?jiān)铀?0mL使溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇提取5次（25 mL、20 mL、20 mL、10 mL、10 mL）,合并提取液，用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次 25 mL，棄去水洗滌液，正丁醇液置水浴上蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 陰性溶液的制備

按處方比例稱取除三七以外的其余藥味，按制備工藝制成缺三七的陰性樣品，按上述供試品溶液制備方法制成缺三七的陰性溶液。

2.4 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取三七皂苷R1﹑人參皂苷Rg1﹑人參皂苷Rb1對(duì)照品適量，加甲醇制成每1mL中含三七皂苷R10.05mg﹑人參皂苷Rg10.2mg﹑人參皂苷Rb10.2mg的混合溶液，即得。

2.5 含量測(cè)定法[8]

分別精密吸取對(duì)照品溶液、陰性溶液與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

在上述選定的色譜條件下，供試品色譜中三七皂苷R1﹑人參皂苷Rg1﹑人參皂苷Rb1的峰能與其它組分色譜峰達(dá)基線分離，且與其它相鄰色譜峰分離度大于1.5；按三七皂苷R1峰計(jì)算，理論板數(shù)在4000以上；陰性溶液色譜中在與人參皂苷Rb1﹑人參皂苷Rg1﹑三七皂苷R1色譜峰相應(yīng)位置上無(wú)色譜峰，說明陰性無(wú)干擾，對(duì)照品、供試品與陰性樣品的色譜圖分別見圖 1、2、3。

圖1 三七止血膠囊對(duì)照品圖譜

圖2 三七止血膠囊樣品測(cè)定圖譜

圖3 三七止血膠囊陰性樣品圖譜

2.5 .1線性關(guān)系的考察

精密吸取濃度為0.0504mg/mL的三七皂苷R1﹑濃度為0.2080mg/mL的人參皂苷Rg1﹑濃度為0.2068mg/mL的人參皂苷Rb1的混合對(duì)照品溶液2、6、10、14、18μL 進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積[20]，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如下：

圖4 三七皂苷R1對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

結(jié)果表明：三七皂苷R1的回歸方程為：y=180232x+3528.5,R2=0.9999，三七皂苷R1在0.1008～0.9072（μg）的進(jìn)樣范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。數(shù)據(jù)見表2，標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖4。

結(jié)果表明：人參皂苷Rg1的回歸方程為:y=196947x+12308;R2=0.9999，人參皂苷Rg1在0.4160～3.7440（μg）的進(jìn)樣范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。數(shù)據(jù)見表3，標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖5。

表2 三七皂苷R1線性關(guān)系考察結(jié)果表

表3 人參皂苷Rg1線性關(guān)系考察結(jié)果表

表4 人參皂苷Rb1線性關(guān)系考察結(jié)果表

結(jié)果表明：人參皂苷Rb1的回歸方程為:y=154206x+12641 R2=0.9999，人參皂苷Rb1在0.4136～3.7224（μg）的進(jìn)樣范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。數(shù)據(jù)見表4，標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見圖6。

圖5 人參皂苷Rg1對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

圖6 人參皂苷Rb1對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.5.2 精密度試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液(20090501)10μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定其峰面積積分值，其結(jié)果見表5。

表5 精密度試驗(yàn)結(jié)果表

表6 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果表

表7 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果表

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別精密吸取供試品溶液(20090501)10μL，于0、3、6、9、12 h 進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積積分值，結(jié)果見表6。

2.5.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品(20090501)按上述含量測(cè)定方法，測(cè)定5次，結(jié)果表明，本法重現(xiàn)性好，見表7。

2.5.5 回收率試驗(yàn)

取已知含量三七皂苷R1為1.25mg/g、人參皂苷Rg1為6.76mg/g和人參皂苷Rb1為4.16mg/g（20090501批）樣品的內(nèi)容物，精密稱定，研細(xì)，取約0.5g，精密稱定，置索氏提取器中，分別精密加入三七皂苷R1的濃度為0.1020mg/mL﹑人參皂苷Rg1的濃度為0.4072mg/mL﹑人參皂苷Rb1的濃度為0.3980mg/mL的混合對(duì)照品溶液5mL，加甲醇適量，加熱回流6 h，取甲醇液置水浴上蒸干。殘?jiān)铀?0mL使溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用水飽和的正丁醇提取 5 次（25mL、20mL、20mL、10mL、10mL）,合并提取液，用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次25mL，棄去水洗滌液，正丁醇液置水浴上蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至25mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；按含量測(cè)定項(xiàng)下的方法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見下表。

2.5.6 藥材的含量測(cè)定

參照《中國(guó)藥典》2008年版一部三七項(xiàng)下的含量測(cè)定方法，對(duì)三批藥材進(jìn)行了三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1三者總量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表11。

為保證藥品的質(zhì)量，規(guī)定三七原藥材中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1三者總量不得低于5.0%。

2.5.7 樣品的測(cè)定與結(jié)果

按上述擬定的含量測(cè)定方法測(cè)定供試品十批，結(jié)果見表 2.12、2.13。

表8 三七皂苷R1的回收率測(cè)定結(jié)果

表9 人參皂苷Rg1的回收率測(cè)定結(jié)果

表10 人參皂苷Rb1的回收率測(cè)定結(jié)果

表11 藥材含量測(cè)定結(jié)果

表13 樣品含量測(cè)定結(jié)果表

結(jié)果表明：十批樣品含量測(cè)定結(jié)果的平均值為3.04mg/粒。按平均含量的70%折算，暫定本品限度為：本品每粒含三七以三七皂苷R1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1的總量計(jì)，不得少于2.0mg。

3 討論

三七止血膠囊中三七為君藥,主含總皂苷,約占4%，亦含黃酮類成分。因地錦草和三七中均含有黃酮成分,含量測(cè)定如選擇黃酮類成份為指標(biāo),專屬性不強(qiáng),所以我們選擇以三七中的三七皂苷R1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Rg1作為控制該制劑含量的檢測(cè)指標(biāo),經(jīng)方法學(xué)考察,本方法準(zhǔn)確可行。

三七止血膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測(cè)定項(xiàng)可測(cè)定三七總皂苷的含量，采用高效液相色譜法測(cè)定。色譜柱：C18（Alltima 250×4.6mm，5μL）流動(dòng)相：以流動(dòng)相A：乙腈，流動(dòng)相B：水，采用梯度洗脫方式測(cè)定，檢測(cè)波長(zhǎng)：203nm；流速：1.0mL/min。理論塔板數(shù)按三七皂苷R1峰計(jì)算應(yīng)不低于4000。此方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，無(wú)陰性干擾。適合收入三七止血膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

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