大腸癌組織中CDK6、Ki67表達(dá)及其與臨床病理因素的關(guān)系

劉壽行，劉 展，謝雪飛，方 圓，喻 宏

（湖南師范大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南省人民醫(yī)院，湖南 長沙 410005）

大腸癌是大腸的惡性上皮性腫瘤，為常見的消化道腫瘤之一,是大腸粘膜上皮在遺傳和環(huán)境等多種致癌因素作用下發(fā)生的惡性改變的漸進(jìn)過程,近年來發(fā)病率不斷提高[1]。

目前研究認(rèn)為腫瘤發(fā)生的本質(zhì)可能是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控，細(xì)胞呈自主的、無限制的增殖。細(xì)胞周期進(jìn)程的實(shí)現(xiàn)依賴于細(xì)胞周期的內(nèi)源性調(diào)控，主要是通過磷酸化和去磷酸化為基礎(chǔ)的周期素、周期素依賴性激酶(CDKs)、CDK抑制劑途徑實(shí)現(xiàn)的，其核心機(jī)制是CDKs活性的表達(dá)和調(diào)控。CDK6是G1期的重要調(diào)控分子之一。它能夠特異性地與周期蛋白D結(jié)合形成復(fù)合物[2]。Ki67抗原是應(yīng)用廣泛的增殖細(xì)胞標(biāo)記之一[3]，是評(píng)估人類各種組織增殖組分的可靠和簡(jiǎn)單的方法，常用Ki67標(biāo)記指數(shù)來表示。但是關(guān)于CDK6和Ki67在大腸癌組織中表達(dá)聯(lián)合檢測(cè)的相關(guān)研究尚未見報(bào)道。本研究擬探討大腸癌組織中CDK6、Ki67蛋白的表達(dá)及與其大腸癌病理因素的關(guān)系及二者之間的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

收集2011年1月～2011年11月湖南省人民醫(yī)院普外科經(jīng)手術(shù)切除的結(jié)、直腸癌標(biāo)本組織84例及相匹配的距腫瘤大于5cm以上的手術(shù)切緣正常大腸組織標(biāo)本48例(均經(jīng)術(shù)后病理證實(shí))；同時(shí)收集患者同期相關(guān)臨床資料，所有患者術(shù)前均未行放、化療?；颊吣行?4例，女性30例，年齡21～82歲，平均年齡60.33歲，結(jié)腸癌50例，直腸癌34例。

1.2 方法

84例大腸癌標(biāo)本及匹配的切緣正常大腸粘膜組織標(biāo)本48例，經(jīng)10%中性福爾馬林固定、脫水、透明、浸蠟、包埋制成石蠟塊。設(shè)定切片厚度為4 μm，行連續(xù)切片形成3個(gè)蠟帶，分別用于HE染色、CDK6、ki67免疫組化染色，HE染色后按照世界衛(wèi)生組織腫瘤學(xué)分類[4]標(biāo)準(zhǔn)將大腸癌按組織學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)分為：低度惡性組59例(高分化3例+中分化56例)、高度惡性組25例(包括低分化腺癌18例、印戒細(xì)胞癌1例，粘液腺癌6例)，結(jié)合患者臨床資料進(jìn)行Dukes分期:按我國大腸癌協(xié)作組方案[5]分為A期13例、B期27例、C期23例、D期21例。

免疫組織化學(xué)染色方法按照即用型非生物素免疫組化ElivisionTM Super檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行，以0.01M PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知多次對(duì)照有效的乳腺癌陽性切片作為陽性對(duì)照。非生物素免疫組化檢測(cè)試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑及Ki67即用型兔抗人單克隆抗體均購自福州邁新生物技術(shù)有限公司，CDK6濃縮型兔抗人多克隆抗體(工作濃度1：200)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.3 結(jié)果判定

采用雙盲法，由兩名有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師分別閱片，如有分歧則經(jīng)討論之后達(dá)成一致，CDK6蛋白及Ki67蛋白表達(dá)以細(xì)胞核內(nèi)可見淡黃色至棕黃色顆粒為陽性，單純細(xì)胞質(zhì)著色或細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)均無著色為陰性，參考Kawasaki[6]和Sinicrope[7]的方法制定免疫組化半定量積分標(biāo)準(zhǔn):染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞數(shù)所占的百分率兩項(xiàng)評(píng)分指標(biāo)相乘。

陽性細(xì)胞數(shù)所占的百分率計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：低倍鏡下觀察著色的大腸癌上皮區(qū)域；高倍鏡下每張切片隨機(jī)選擇10個(gè)完整而不重疊的視野，觀察陽性細(xì)胞數(shù)占整格腫瘤細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)比例(每格高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算其平均數(shù))。分為5組：<5%計(jì)為O分，5%-25%為1分，26%-50%為2分，51-75%為3分，>75%為4分。染色強(qiáng)度計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項(xiàng)積分相乘，所得乘積分為4個(gè)級(jí)別，0分記"-"為陰性，1-4分記"+"為弱陽性，5-8分記"++"為陽性，9-12分以上記"+++"為強(qiáng)陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,率的比較采用χ2檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)的校正公式和Fisher精確概率法,等級(jí)資料的相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CDK6在大腸癌組織和切緣大腸正常組織中的表達(dá)情況

共分析了84例大腸癌組織和48例切緣正常大腸組織中CDK6的表達(dá)，結(jié)果顯示，CDK6主要在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，胞漿也部分表達(dá)，如圖1所示。大腸癌組織中CDK6表達(dá)的陽性率為88.1%(74/84)，切緣正常大腸組織中CDK6表達(dá)的陽性率為10.4%(5/48)。大腸癌組織中CDK6表達(dá)的陽性率比切緣正常大腸組織中高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=76.7，P<0.005)。 見表 1。

表1 大腸癌組和切緣正常大腸粘膜組中CDK6表達(dá)情況

2.2 Ki67在大腸癌組織和切緣大腸正常組織中的表達(dá)情況

結(jié)果顯示，Ki67在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，如圖2所示。大腸癌組織中Ki67表達(dá)的陽性率為92.9%(78/84)，切緣正常大腸組織中Ki67表達(dá)的陽性率為20.8%(10/48)。在大腸癌組織中Ki67表達(dá)的陽性率比切緣正常大腸組織中高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=71.304，P<0.005)。 見表 2。

表2 大腸癌組和切緣正常大腸粘膜組中Ki67表達(dá)情況

2.3 CDK6、Ki67表達(dá)與大腸癌臨床病理因素的關(guān)系

由表3可見，CDK6蛋白表達(dá)陽性率與腫瘤浸潤深度、Dukes分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度有關(guān)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與患者年齡、性別、腫瘤發(fā)生部位、腫瘤大體類型無關(guān) (P>0.05)。Ki67蛋白表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤大體形態(tài)、浸潤深度、Dukes分期、腫瘤分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間無明顯相關(guān)性(P>0.05)。

2.4 CDK6與Ki67在大腸癌組織中表達(dá)的相關(guān)關(guān)系

84例大腸癌中CDK6及Ki67的表達(dá)如下表所示，雙變量的等級(jí)資料之間的相關(guān)關(guān)系分析屬于非參數(shù)統(tǒng)計(jì)方法，采用Spearman秩相關(guān)分析，使用等級(jí)相關(guān)系數(shù)r來說明CDK6及Ki67兩個(gè)變量間直線相關(guān)關(guān)系的密切程度與相關(guān)方向。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，CDK6與Ki67在大腸癌中的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系 (r=0.581，P=0.000)，在大腸癌組織中Ki67蛋白表達(dá)的強(qiáng)度隨CDK6表達(dá)強(qiáng)度的增強(qiáng)而升高。結(jié)果見表4。

3 討論

大腸癌是胃腸道常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐漸增長趨勢(shì)。隨著2001年的諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)授予了發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白依賴激酶(cyclin dependent kinases,CDKs)和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白(Cyclins)及其有關(guān)分子的科學(xué)家，CDKs和Cyclins及其相關(guān)分子成為了目前細(xì)胞周期調(diào)控研中的熱點(diǎn)[8]。1994年，研究者發(fā)現(xiàn)人類脊椎動(dòng)物cdc-2相關(guān)激酶家族的一個(gè)新成員：CDK6[9]。CDK6基因位于人類七號(hào)染色體上，包含7個(gè)外顯子，編碼40kDa的蛋白質(zhì)。CDK6是G1期 的重要調(diào)控分子之一，近年來,CDK6與腫瘤發(fā)生發(fā)展之間的密切關(guān)系得到了一些研究。研究發(fā)現(xiàn)CDK6在多種腫瘤細(xì)胞中過量表達(dá)，鄭美蓉[10]等用原位分子雜交技術(shù)研究了肝癌組織中CDK6mRNA表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)CDK6mRNA在肝細(xì)胞癌組織中呈弱陽性表達(dá)，而在正常肝細(xì)胞中不表達(dá)，說明CDK6可能參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。研制CDK6抑制劑，可作為腫瘤治療的新靶點(diǎn)[11]。也可將CDK6作為診斷工具，通過測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的CDK6水平確定細(xì)胞是正常還是已發(fā)生癌變。

表3 CDK6、Ki67表達(dá)與大腸癌臨床病理因素的關(guān)系

表4 CDK6與Ki67在大腸癌中表達(dá)的關(guān)系

細(xì)胞核相關(guān)抗原(Ki67)的人類基因定位于第10號(hào)染色體的長臂上，是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期必不可少的組成部分，其表達(dá)因細(xì)胞周期不同時(shí)相而異，與細(xì)胞增殖密切相關(guān),可作為評(píng)價(jià)細(xì)胞生長分?jǐn)?shù)的指標(biāo)[12]。

本研究顯示，CDK6蛋白主要在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)，胞漿也部分表達(dá)，在大腸癌組織中CDK6蛋白的陽性表達(dá)率較切緣正常大腸粘膜陽性率明顯升高，CDK6蛋白表達(dá)與腫瘤浸潤深度、Dukes分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度相關(guān)。提示CDK6可能參與了大腸癌發(fā)生發(fā)展，與大腸癌預(yù)后有關(guān)。Ki67蛋白定位在細(xì)胞核，在大腸癌組織中Ki67蛋白的陽性表達(dá)率較切緣正常大腸粘膜陽性率明顯升高，本研究顯示Ki67表達(dá)與腫瘤浸潤深度、Dukes分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分化程度之間無明顯相關(guān)關(guān)系。提示Ki67可能是大腸癌發(fā)生中的早期分子事件。

采用Spearman秩相關(guān)分析雙變量(CDK6、Ki67)等級(jí)資料之間的相關(guān)關(guān)系，使用等級(jí)相關(guān)系數(shù)r來說明CDK6及Ki67兩個(gè)變量間直線相關(guān)關(guān)系的密切程度與相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)CDK6與Ki67在大腸癌中的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系。

本研究結(jié)果提示檢測(cè)大腸癌組織中CDK6及Ki67表達(dá)可以更加有依據(jù)說明組織是否發(fā)生了癌變，與組織細(xì)胞形態(tài)學(xué)相結(jié)合，應(yīng)用于大腸癌的輔助診斷。CDK6、Ki67蛋白參與了大腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程，發(fā)揮了癌基因的作用，CDK6在評(píng)價(jià)大腸癌患者預(yù)后中具有一定的價(jià)值。

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