凍蝦仁中一株發(fā)酵阿拉伯糖的溶藻弧菌的分離鑒定

陳偉峰 朱露 洪舒音 趙秀玲

摘要：在對(duì)一份凍蝦仁樣品的檢測(cè)過(guò)程中分離到一株弧菌，經(jīng)過(guò)形態(tài)觀察、自動(dòng)生化測(cè)試和手工生化測(cè)試，最終鑒定為發(fā)酵阿拉伯糖的特殊生化型溶藻弧菌。敘述了檢測(cè)、分離和鑒定的過(guò)程，并對(duì)弧菌鑒定的方法選擇和弧菌病的防治作了探討。

關(guān)鍵詞：凍蝦仁；溶藻弧菌；阿拉伯糖；分離鑒定

中圖分類號(hào)：Ｑ９３９．１文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８114（２０12）16－3479-04

Isolation and Identification of a Vibrio alginolyticus Strain Fermenting Arabinose from Frozen Shrimp

ＣＨＥＮ Ｗｅｉ－fｅｎｇ１，ＺＨＵ Ｌｕ２，ＨＯＮＧ Ｓｈｕ－yｉｎ１，ＺＨＡＯ Ｘｉｕ－lｉｎｇ１

（１． Ｆｅｎｇｈｕａ Eｎｔｒｙ－ｅｘｉｔ Iｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Qｕａｒａｎｔｉｎｅ Bｕｒｅａｕ，Ｆｅｎｇｈｕａ ３１５５００，Ｚｈｅｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ；

２．Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｎｉｎｇｂｏ ３１５０２０， Ｚｈｅｊｉａｎｇ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ａ Ｖｉｂｒｉｏ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｆｒｏｚｅｎ ｓｈｒｉｍｐ ａｎｄ ｕｌｔｉｍａｔｅｌｙ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ ａ ｒａｒｅ Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ ｓｔｒａｉｎ ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ ａｒａｂｉｎｏｓｅ ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｔｅｓｔｓ． Ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ， ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗａｓ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ， ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｖｉｂｒｉｏ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｖｉｂｒｉｏ ｄｉｓｅａｓｅ ｗａｓ ｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｆｒｏｚｅｎ ｓｈｒｉｍｐ； Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ； ａｒａｂｉｎｏｓｅ； ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ

溶藻弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）是１２種人類致病性弧菌之一，專性嗜鹽，廣泛分布于海洋和江河入海口的水域中，數(shù)量居海水類弧菌之首。該菌最初被劃分為副溶血性弧菌的生物Ⅱ型，后來(lái)根據(jù)基因組同源性分析結(jié)果將其劃為一個(gè)獨(dú)立的種［１］。溶藻弧菌是水產(chǎn)養(yǎng)殖，特別是海水養(yǎng)殖中重大流行病的引發(fā)源之一，可引起魚(yú)類潰瘍病、蝦類紅腿病、白斑病等［２］。該菌也是人類的條件致病菌，可引起人類食物中毒［３］、傷口感染［４］、筋膜炎［５］等疾病。林業(yè)杰等［６］的研究發(fā)現(xiàn)有5.0％的溶藻弧菌檢出ＳＴ腸毒素、２０.0％的溶藻弧菌檢出ＬＴ腸毒素、８８．１％的溶藻弧菌菌株能產(chǎn)生溶血素，因而認(rèn)為該種細(xì)菌可能含有多種致病因子，應(yīng)當(dāng)與副溶血性弧菌同等重視。

通過(guò)菌落形態(tài)觀察、嗜鹽性試驗(yàn)、糖發(fā)酵試驗(yàn)和其他生化試驗(yàn)，可以將溶藻弧菌和副溶血性弧菌、霍亂弧菌等常見(jiàn)致病性弧菌區(qū)分開(kāi)來(lái)。對(duì)一份凍蝦仁樣品檢測(cè)過(guò)程中分離到的一株弧菌經(jīng)過(guò)形態(tài)觀察、自動(dòng)生化測(cè)試和手工生化測(cè)試，最終鑒定為發(fā)酵阿拉伯糖的溶藻弧菌菌株，是一種罕見(jiàn)的生化型，同時(shí)對(duì)弧菌鑒定的方法選擇和弧菌病的防治作了探討。

１材料與方法

１．１材料

出口企業(yè)送檢的凍蝦仁樣品。

１．２主要試劑

緩沖蛋白胨水、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（ＴＴＢ）、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（ＳＣ）、亞硫酸鉍瓊脂（ＢＳ）、Ｈｅｋｔｏｅｎ Ｅｎｔｅｒｉｃ瓊脂（ＨＥ）、硫代硫酸鹽－檸檬酸鹽－膽鹽－蔗糖瓊脂（ＴＣＢＳ）、微量生化管均為北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；ＧＮＩ＋革蘭氏陰性菌測(cè)試卡及配套試劑、ＡＰＩ ２０Ｅ（腸桿菌等革蘭氏陰性菌測(cè)試條）均為法國(guó)生物梅里埃公司產(chǎn)品；弧菌顯色培養(yǎng)基（法國(guó)科瑪嘉）。

１．３試驗(yàn)方法

１．３．１增菌培養(yǎng)和菌株分離按《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)》（ＧＢ ４７８９．４－２０１０）［７］對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)。?。玻?ｇ樣品加入到２２５ ｍＬ緩沖蛋白胨水中，充分均質(zhì)后３６．０ ℃培養(yǎng)１８ ｈ。分別取１ ｍＬ培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至１０ ｍＬ ＴＴＢ和１０ ｍＬ ＳＣ中，增菌培養(yǎng)２４ ｈ后劃線接種至ＢＳ和ＨＥ平板。

１．３．２挑取可疑菌落與自動(dòng)生化鑒定挑取可疑菌落，接種于三糖鐵斜面上，并用營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板純化，菌株編號(hào)為５４１２－１。純化菌株進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，按ＧＢ ４７８９．４－２０１０進(jìn)行賴氨酸脫羧酶、靛基質(zhì)、尿素酶和氰化鉀試驗(yàn)。測(cè)定氧化酶活性，按ＧＮＩ＋革蘭氏陰性菌測(cè)試卡使用說(shuō)明進(jìn)行自動(dòng)生化測(cè)試，測(cè)試設(shè)備為ＶＩＴＥＫ ３２微生物分析系統(tǒng)。

１．３．３弧菌選擇性培養(yǎng)基觀察與微量生化測(cè)試根據(jù)自動(dòng)生化測(cè)試結(jié)果，初步判斷５４１２－１菌株為弧菌屬細(xì)菌。將該菌株接種到ＴＣＢＳ和弧菌顯色培養(yǎng)基中，觀察菌落形態(tài)。參照ＧＢ／Ｔ ４７８９．７－２００８《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 副溶血性弧菌檢驗(yàn)》［８］和《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》［１］關(guān)于弧菌屬內(nèi)常見(jiàn)菌株的生化特征的描述，對(duì)５４１２－１菌株的耐鹽生長(zhǎng)能力和主要生化指標(biāo)進(jìn)行了進(jìn)一步研究。

１．３．４ＡＰＩ ２０Ｅ確認(rèn)試驗(yàn)新鮮培養(yǎng)的菌落加入到５ ｍＬ ０．８５％ＮａＣｌ培養(yǎng)液中制成１．０麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙?。按要求將菌懸液加入到ＡＰ?２０Ｅ試劑條的測(cè)試孔中，培養(yǎng)過(guò)夜觀察結(jié)果。

２結(jié)果與分析

２．１平板分離與初步鑒定結(jié)果

在對(duì)一份凍蝦仁樣品進(jìn)行沙門(mén)氏菌項(xiàng)目的檢測(cè)過(guò)程中，在ＨＥ平板上發(fā)現(xiàn)藍(lán)綠色圓形的菌落（圖１a），挑取典型菌落純化，編號(hào)為５４１２－１。該菌株經(jīng)染色觀察，為革蘭氏陰性桿菌。按照ＧＢ ４７８９．４－２０１０測(cè)定其生化特征，結(jié)果為不產(chǎn)Ｈ２Ｓ，尿素酶、賴氨酸脫羧酶、靛基質(zhì)和氰化鉀試驗(yàn)均為陰性。使用ＧＮＩ＋革蘭氏陰性菌鑒定卡進(jìn)行自動(dòng)生化測(cè)試（用０．４５％ ＮａＣｌ溶液作稀釋液），結(jié)論為５０％溶藻弧菌／４９％副溶血性弧菌。以上結(jié)果排除了５４１２－１是沙門(mén)氏菌的可能，并提示該菌株很可能是弧菌。因此使用０．８５％ ＮａＣｌ溶液作稀釋液再次進(jìn)行自動(dòng)生化測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)表1。測(cè)試結(jié)論為６６％副溶血性弧菌／１７％溶藻弧菌，尚無(wú)法得到可接受的鑒定結(jié)果，需用其他方法進(jìn)一步鑒定。

２．２弧菌選擇性平板觀察與微量生化測(cè)試結(jié)果

菌株５４１２－１在ＴＣＢＳ和弧菌顯色培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況見(jiàn)圖１ｂ和圖１ｃ。在ＴＣＢＳ培養(yǎng)基上呈黃色圓形菌落，直徑約１～２ ｍｍ。在弧菌顯色培養(yǎng)基上呈白色圓形菌落。參照ＧＢ／Ｔ ４７８９．７－２００８和《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》，使用常規(guī)手工方法測(cè)試５４１２－１菌株的生化特征，結(jié)果見(jiàn)表２。結(jié)合菌株５４１２－１的菌落形態(tài)和生化特征，該菌株與典型溶藻弧菌最接近，但對(duì)阿拉伯糖的發(fā)酵能力有差異；與副溶血性弧菌在１０％ＮａＣｌ生長(zhǎng)試驗(yàn)、蔗糖發(fā)酵和ＶＰ試驗(yàn)中存在差異。

２．３ＡＰＩ ２０Ｅ試驗(yàn)確認(rèn)結(jié)果

為準(zhǔn)確鑒定５４１２－１菌株，使用ＡＰＩ ２０Ｅ測(cè)試條對(duì)以上結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)，結(jié)果（表３）表明，５４１２－１與溶藻弧菌之間阿拉伯糖發(fā)酵試驗(yàn)不符，ＶＰ和苦杏仁苷發(fā)酵試驗(yàn)符合度較低。鑒定數(shù)值為４１４７１２７，查詢ＡＰＩ ２０Ｅ數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)論為８７．４％溶藻弧菌，為可接受的鑒定結(jié)果。綜合以上形態(tài)和生化測(cè)試結(jié)果，可將５４１２－１菌株鑒定為一株罕見(jiàn)的發(fā)酵阿拉伯糖的溶藻弧菌。

３小結(jié)與討論

在一份凍蝦仁樣品中分離到一株溶藻弧菌，ＧＮＩ＋自動(dòng)生化測(cè)試、常規(guī)手工生化測(cè)試和ＡＰＩ ２０Ｅ測(cè)試結(jié)果均顯示該細(xì)菌能夠發(fā)酵阿拉伯糖。根據(jù)文獻(xiàn)統(tǒng)計(jì)，這種生化型只占１％，比較罕見(jiàn)［１］。而且這一特殊菌株是在用于沙門(mén)氏菌等腸桿菌科細(xì)菌分離的ＨＥ平板上得到，更是未見(jiàn)類似報(bào)道。ＶＩＴＥＫ 32自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)是一種快速準(zhǔn)確的微生物鑒定設(shè)備，目前已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療和工業(yè)領(lǐng)域。但該系統(tǒng)在弧菌鑒定領(lǐng)域是相對(duì)的弱項(xiàng)［９］，在鑒定５４１２－１這一特殊生化型菌株時(shí)經(jīng)過(guò)反復(fù)測(cè)試均未能得到滿意結(jié)果，只提示該菌株可能是弧菌。常規(guī)手工生化測(cè)試和ＡＰＩ ２０Ｅ則取得了可以接受的鑒定結(jié)果。所以在弧菌檢測(cè)中應(yīng)避免絕對(duì)化，不應(yīng)過(guò)于依賴儀器，對(duì)于儀器給出的鑒定報(bào)告應(yīng)當(dāng)詳細(xì)審查，為污染控制、疾病防治提供可靠依據(jù)。

溶藻弧菌在水環(huán)境和水產(chǎn)品中的含量較高，給水產(chǎn)養(yǎng)殖和人類健康帶來(lái)重大威脅。由于人們對(duì)溶藻弧菌的認(rèn)識(shí)起步較晚，對(duì)其防治措施的研究較霍亂弧菌和副溶血性弧菌差距較大。在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)主要通過(guò)使用抗生素來(lái)控制溶藻弧菌病害，但這種方法易引起病菌抗藥性增強(qiáng)，污染水體和環(huán)境，并間接危害人體健康。近年來(lái)，陸續(xù)研發(fā)出一些新的防治方法，主要有益生菌法，如利用乳酸菌［１０］和枯草芽孢桿菌［１１，１２］改善水產(chǎn)品和養(yǎng)殖環(huán)境的微生態(tài)；免疫增強(qiáng)劑法，如使用海藻酸鈉［１３］、幾丁質(zhì)和殼聚糖［１４］、中草藥［１５］等增強(qiáng)水產(chǎn)動(dòng)物的先天免疫體系；接種溶藻弧菌疫苗，包括菌體疫苗［１６］、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)疫苗［１７］和ＤＮＡ疫苗［１８］。但這些新方法大多仍處于試驗(yàn)階段，商品化、低成本、易操作的產(chǎn)品很少。水產(chǎn)品生產(chǎn)加工中的衛(wèi)生處理也是減少溶藻弧菌污染的重要環(huán)節(jié)。常見(jiàn)有紫外殺菌法和殺菌劑法（二氧化氯、次氯酸鈉和臭氧水等）［１９］，應(yīng)綜合殺菌效果和產(chǎn)品銷售地區(qū)的消毒劑限量要求選擇衛(wèi)生處理方法。人體溶藻弧菌病的預(yù)防主要是要形成科學(xué)的飲食和生活習(xí)慣，生食水產(chǎn)品、腌制海產(chǎn)品和水上運(yùn)動(dòng)時(shí)不注意清潔衛(wèi)生［２０］等行為均可能引發(fā)感染。因溶藻弧菌引起的食物中毒或感染可有選擇地采用抗生素治療［２１］。隨著人們對(duì)溶藻弧菌危害的認(rèn)識(shí)逐步加強(qiáng)，對(duì)其污染的預(yù)防和控制也越來(lái)越受重視。目前最需要做的是制定溶藻弧菌檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和限量規(guī)范，開(kāi)發(fā)適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖、加工的防治方法，以及總結(jié)人類感染溶藻弧菌的案例和治療方案。

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