榨菜下胚軸離體培養(yǎng)植株再生體系的建立

張艷梅 于錫宏 蔣欣梅 盧志權 叢超

摘要：以榨菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ Ｃｚｅｒｎ． ｅｔ Ｃｏｓｓ． ｖａｒ． ｔｕｍｉｄａ）Ｂ２－１０１４的下胚軸為外植體，研究了不同濃度的激素以及不同激素組合對愈傷組織、不定芽和不定根誘導的影響。結果表明，榨菜莖段離體培養(yǎng)的植株高頻再生體系中愈傷組織誘導培養(yǎng)基為ＭＳ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．８ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ，不定芽誘導培養(yǎng)基為ＭＳ＋２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ，不定根誘導培養(yǎng)基為ＭＳ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ，在此培養(yǎng)條件下，Ｂ２－１０１４愈傷組織的誘導率達９０．０％，不定芽誘導率達９２．２％，不定根誘導率達９７．８％。

關鍵詞：榨菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ Ｃｚｅｒｎ． ｅｔ Ｃｏｓｓ． ｖａｒ． ｔｕｍｉｄａ）；下胚軸；組織培養(yǎng)；再生植株

中圖分類號：Ｑ９４９．７４８．３；Ｑ９４３．１文獻標識碼：Ａ 文章編號：0439－８114（２０12）16－3628-04

Establishment of the Regeneration System for in vitro Hypocotyl Culture of

Brassica juncea var. tumida

ＺＨＡＮＧ Ｙａｎ－ｍｅｉ，ＹＵ Ｘｉ－ｈｏｎｇ，ＪＩＡＮＧ Ｘｉｎ－ｍｅｉ，ＬＵ Ｚｈｉ－ｑｕａｎ，ＣＯＮＧ Ｃｈａｏ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ， Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｒｂｉｎ １５００３０， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ ｏｆ ｐｉｃｋｌｅ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ Ｃｚｅｒｎ．ｅｔ Ｃｏｓｓ． ｖａｒ． ｔｕｍｉｄａ） ｍａｔｅｒｉａｌ Ｂ２－１０１４ ａｓ ｅｘｐｌａｎｔ， ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｈｏｒｍｏｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｎ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ， ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄ ａｎｄ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｒｏｏｔ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｏｐｔｉｍｕｍ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｃａｌｌｕｓ， ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄ ａｎｄ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｒｏｏｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｗａｓ ＭＳ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．８ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ， ＭＳ＋２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ， ａｎｄ ＭＳ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ； ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ， ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｂｕｄ ａｎｄ ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ ｒｏｏｔ of Ｂ２－１０１４ ｃｏｕｌｄ ｒｅａｃｈ up ｔｏ ９０．０％， ９２．２％， ａｎｄ ９７．８％ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｐｉｃｋｌｅ（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ Ｃｚｅｒｎ． ｅｔ Ｃｏｓｓ． ｖａｒ． ｔｕｍｉｄａ）； ｈｙｐｏｃｏｔｙｌ； ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ； ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｌａｎｔ

榨菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｊｕｎｃｅａ Ｃｚｅｒｎ． ｅｔ Ｃｏｓｓ． ｖａｒ． ｔｕｍｉｄａ）屬十字花科蕓薹屬芥菜種中以肉質莖為產(chǎn)品的一個變種，屬于莖用芥菜。榨菜是中國特產(chǎn)蔬菜，在國際市場上與歐洲酸菜、日本醬菜齊名，被譽為世界三大名腌菜之一，在中國蔬菜加工生產(chǎn)中占有重要的地位，對提高農(nóng)民收入、發(fā)展鄉(xiāng)鎮(zhèn)企業(yè)、提供就業(yè)機會以及出口創(chuàng)匯等有著重要意義。

關于離體培養(yǎng)，在蕓薹屬作物大白菜和青花菜等植株的再生體系方面有很多的相關報道［１－３］，對于榨菜離體培養(yǎng)，已通過帶柄子葉、下胚軸培養(yǎng)獲得了再生植株［４，５］，陳石頭等［４］報道的再生頻率高達９０％以上，其他研究的再生頻率較低，一般為５０％～６０％［６］。采用不同株系的榨菜、不同的激素［7］、不同培養(yǎng)基，榨菜離體培養(yǎng)的植株再生體系就有可能不同，試驗通過對榨菜的下胚軸進行離體培養(yǎng)，研究榨菜的不同株系、不同苗齡以及不同激素組合對再生體系的影響，旨在尋找榨菜外植體離體培養(yǎng)的適宜條件，為榨菜育種材料的保存和繁殖提供可靠的試驗方法，也為榨菜多倍體育種打下良好的基礎。

１材料與方法

１．１材料

榨菜Ｂ２－１０１４、Ｂ２－１０２０、ＢＺ⊕－１００５、ＢＺ⊕－１００３由東北農(nóng)業(yè)大學蔬菜生理與設施園藝研究室提供，激素６－ＢＡ、２，４－Ｄ、ＮＡＡ由鄭州綠博生物科技有限公司提供。

１．２方法

１．２．１無菌苗的獲得參照陳竹君等［8］的方法，將精選后的榨菜種子先用體積分數(shù)為７０％的乙醇振蕩滅菌９０ ｓ，接下來加入１００ ｇ／Ｌ次氯酸鈉溶液振蕩滅菌１０ ｍｉｎ，然后用無菌水沖洗５次，最后接種于ＭＳ培養(yǎng)基上。于（２５±２） ℃下光照培養(yǎng)，光照度為２ ０００ ｌｘ，光照時間為１６ ｈ／ｄ。

１．２．２榨菜株系種類的篩選選用榨菜Ｂ２－１０１４、Ｂ２－１０２０、ＢＺ⊕－１００５和ＢＺ⊕－１００３這４種株系進行無菌培育，培育４ ｄ后取下胚軸接種于ＭＳ培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導。每種培養(yǎng)基中均添加３０ ｇ／Ｌ蔗糖、８ ｇ／Ｌ瓊脂、２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ和０．４ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ［４］，接種１４ ｄ后統(tǒng)計愈傷組織的誘導率。每個處理的外植體為３０個，３次重復。

１．２．３榨菜苗齡大小的篩選將不同苗齡（３、４、５、６、７ ｄ）榨菜幼苗的下胚軸切成０．５ ｃｍ小段，接種于ＭＳ培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導。每種培養(yǎng)基中均添加３０ ｇ／Ｌ蔗糖、８ ｇ／Ｌ瓊脂、２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ和０．４ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ。接種１４ ｄ后統(tǒng)計愈傷組織的誘導率。每個處理的外植體為３０個，３次重復。

１．２．４基本培養(yǎng)基的篩選以Ｂ２－１０１４為試材，將培養(yǎng)５ ｄ的榨菜無菌苗下胚軸切成０．５ ｃｍ小段，接種于基本培養(yǎng)基ＭＳ、１／２ＭＳ、１／４ＭＳ和１／８ＭＳ中進行愈傷組織誘導。每種基本培養(yǎng)基中均添加３０ ｇ／Ｌ蔗糖、８ ｇ／Ｌ瓊脂、２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ和０．４ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ。接種１４ ｄ后統(tǒng)計愈傷組織的誘導率。每個處理的外植體為３０個，３次重復。

１．２．５不同激素組合對愈傷組織誘導的影響將培養(yǎng)５ ｄ的Ｂ２－１０１４無菌苗下胚軸切成０．５ ｃｍ小段，接種于含不同濃度的６－ＢＡ和２，４－Ｄ、６－ＢＡ和ＮＡＡ組合的培養(yǎng)基ＭＳ中誘導愈傷組織形成，不含有激素的為對照，激素組合見表１、表２。接種１４ ｄ后統(tǒng)計愈傷組織的誘導率。每個處理的外植體為３０個，３次重復。

１．２．６不定芽的誘導利用篩選出的基本培養(yǎng)基，將繼代培養(yǎng)后的愈傷組織轉移至含不同濃度６－ＢＡ和ＮＡＡ（表３）的培養(yǎng)基中誘導不定芽形成。１６ ｄ后調查不定芽的誘導率。不含有激素的處理作對照。每個處理的外植體為３０個，３次重復。

１．２．７不定根的誘導與移栽利用篩選出的基本培養(yǎng)基，從不定芽上切?。病?ｃｍ的再生芽，接種于含不同濃度（０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７ ｍｇ／Ｌ）ＮＡＡ的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，培養(yǎng)２～３周后統(tǒng)計不定根的誘導率，每個處理的外植體為３０個，３次重復。

將生根后的小苗去掉封口膜，放在實驗室中煉苗３ ｄ，將苗取出，并用自來水洗去小植株根部附著的培養(yǎng)基，將小植株移栽于營養(yǎng)缽中保濕１周左右，計算成活率。

２結果與分析

２．１榨菜株系種類的篩選結果

不同榨菜株系愈傷組織的誘導率是不同的，由表４可知，Ｂ２－１０１４愈傷組織誘導的效果最好，誘導率高達９０．０％，而其他３種株系Ｂ２－１０２０、ＢＺ⊕－１００５、ＢＺ⊕－１００３愈傷組織的誘導率很低，均不超過５０％，不同株系之間誘導率差異顯著。因此，最佳榨菜株系為Ｂ２－１０１４。

２．２榨菜苗齡大小的篩選結果

由表５可知，不同苗齡榨菜愈傷組織的誘導效果有顯著的差異，３ ｄ苗齡榨菜幼苗的愈傷組織誘導率最低，４ ｄ苗齡榨菜的愈傷組織誘導率最高，為９０．０％，之后隨著榨菜苗齡的增加，誘導率逐漸下降。植物在個體發(fā)育時會經(jīng)歷幼態(tài)期、成熟期和衰老期，一般情況下，幼態(tài)組織比老態(tài)組織具有較強的形態(tài)發(fā)生能力［9］。因此，榨菜的最佳苗齡為４ ｄ。

２．３基本培養(yǎng)基的篩選結果

由表６可知，基本培養(yǎng)基ＭＳ的愈傷組織誘導率最高，達到了４７．８％，顯著高于其他基本培養(yǎng)基（１／２ＭＳ、１／４ＭＳ、１／８ＭＳ），基本培養(yǎng)基１／２ＭＳ、１／４ＭＳ、１／８ＭＳ的愈傷組織誘導率差異不顯著。

２．４不同激素組合對愈傷組織誘導的影響

不同激素組合（６－ＢＡ和２，４－Ｄ、６－ＢＡ和ＮＡＡ）對愈傷組織誘導產(chǎn)生了一定的影響（表７，圖１Ａ），其中處理Ｈ９（０．５ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．８ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ）的愈傷組織誘導率最高，達到了９０．０％，顯著高于其他處理。同時，在含有２，４－Ｄ的培養(yǎng)基中愈傷組織的誘導效果明顯不如含ＮＡＡ的誘導效果好。

２．５不同濃度激素組合對不定芽誘導的影響

１６ ｄ后在多數(shù)培養(yǎng)基上均能分化出不定芽（表８，圖１Ｂ），其中處理Ｋ２７（２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ）的培養(yǎng)效果最好，不定芽誘導率最高，達到了９２．２％，顯著高于其他處理。試驗結果表明，較高濃度的６－ＢＡ結合較低濃度的ＮＡＡ有利于不定芽的分化。

２．６不同濃度ＮＡＡ對不定根誘導的影響

在８種培養(yǎng)基上均形成不定根（表９，圖１C），當ＮＡＡ濃度達到０．２ ｍｇ／Ｌ時，不定根的誘導率達到最大，即培養(yǎng)基ＭＳ＋ＮＡＡ ０．２ ｍｇ／Ｌ的生根效果最好，其根系粗壯，根毛較多，不定根誘導率高達９７．８％，顯著高于其他處理；隨后不定根誘導率隨著ＮＡＡ濃度的繼續(xù)增大而降低。當ＮＡＡ濃度低于０．２ ｍｇ／Ｌ時只產(chǎn)生少數(shù)不定根或不發(fā)根，根毛也少；過高濃度ＮＡＡ會使芽的基部產(chǎn)生大量愈傷組織，抑制不定根的形成。

將在實驗室馴化后的再生植株移栽到沙質混合基質中，蓋上塑料薄膜在溫室保濕培養(yǎng)１周，然后移栽到土壤中，進行正常的田間管理，發(fā)現(xiàn)成活率可達９９％以上，且植株生長良好（圖１D）。

３小結與討論

建立高頻再生體系是進行植物遺傳轉化的前提。芥菜類的愈傷組織難以分化主要受基因型、外植體種類、培養(yǎng)基成分、激素種類和濃度的限制［１0］。利用下胚軸同樣能獲得很高的再生頻率，在利用榨菜下胚軸組織培養(yǎng)時再生頻率達到了９０％以上［３，１1］。可見，不同的外植體分化所需的條件不同，若給予適當?shù)臈l件，外植體均可能分化出芽。

對不同蔬菜用不同外植體進行芽增殖或愈傷組織誘導時，培養(yǎng)基中添加的激素濃度和種類不盡相同［１2］，Ｔａｋａｓａｋｉ等［１3］也曾報道在白菜子葉培養(yǎng)中6-ＢＡ和ＮＡＡ是必不可少的激素。而甘藍型油菜的子葉培養(yǎng)，只有6-ＢＡ是必需的激素。在此次試驗中，榨菜外植體的分化需要6-ＢＡ和ＮＡＡ。不同種類的生長素的作用有明顯差異，ＮＡＡ的效果顯著優(yōu)于２，４－Ｄ。在含有２，４－Ｄ的培養(yǎng)基上，外植體分化比較慢，誘導效果差。

總之，利用下胚軸作為外植體進行離體培養(yǎng)的最佳植株再生體系為愈傷組織誘導培養(yǎng)基ＭＳ＋０．５ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．８ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ，不定芽誘導培養(yǎng)基ＭＳ＋２．０ ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ，不定根誘導培養(yǎng)基ＭＳ＋０．２ ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ，在此培養(yǎng)條件下，Ｂ２－１０１４愈傷組織的誘導率達９０．０％，不定芽誘導率達９２．２％，不定根誘導率達９７．８％。下胚軸離體培養(yǎng)的研究為下一步榨菜株系多倍體誘導打下了基礎。

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